本文關鍵詞：骨肉瘤中GRM4基因表達和啟動子甲基化的研究及其臨床意義

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【摘要】：研究背景：骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。對于那些在診斷的時候沒有發(fā)生轉移的患者,其5年生存率可達70%。盡管取得了許多進展,然而其余的有轉移的或者對化療不敏感的骨肉瘤患者,其5年生存率只有20%左右。骨肉瘤的真正病因尚不清楚,其發(fā)生發(fā)展過程是一個包括環(huán)境因素和遺傳因素的多因素過程。表觀遺傳學的最新研究進展表明,表觀遺傳改變可引起骨肉瘤的惡性轉化和進展,讓我們可以更好地了解這種腫瘤的分子機制。代謝型谷氨酸受體4(mGluR4)主要是突觸前谷氨酸受體,其在控制運動的基底神經節(jié)環(huán)路的數個關鍵位置表達,參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經傳遞。研究表明代謝型谷氨酸受體4(mGluR4)在多種腫瘤中表達并與其進組預后相關,在成骨細胞和破骨細胞中mGluR4的表達表明谷氨酸信號參與骨形成和骨吸收過程中的細胞分化與調控。目的：研究表明在骨肉瘤中代謝型谷氨酸受體4(mGluR4)呈高表達狀態(tài)。本研究檢測63例骨肉瘤患者的骨組織和105例非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因啟動子甲基化狀態(tài)以及表達情況,探討GRM4基因啟動子甲基化與其表達的關聯(lián)及其在骨肉瘤中的臨床意義。方法：研究對象及標本：收集2010年1月-2012年7月期間在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院診療的骨肉瘤患者組織標本63例。所有患者術前未進行相關抗癌治療措施,所有標本經過病理學檢查確認為骨肉瘤。取得的標本在切除后立即置入液氮罐冷凍保存,然后轉到-80℃條件下低溫保存。取得105例非腫瘤患者的骨組織作為對照組,同樣經液氮冷凍低溫保存,后轉到-80℃低溫冰箱保存用于基因甲基化、RNA和蛋白測定。并且收集患者的臨床和組織學資料,如年齡、性別、Enneking分期、轉移、腫瘤部位、組織學類型。所有患者均進行隨訪,術后前2年內每2個月進行1次隨訪,在接下來的隨訪過程中每6個月隨訪一次,平均隨訪時間為20個月(1月-36月)。這項研究由廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準,每一位患者在告知的情況下簽署知情同意書。GRM4基因啟動子甲基化的測定：通過焦磷酸測序的方法檢測骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因啟動子的甲基化狀態(tài)。GRM4基因mRNA表達的測定：通過RT-PCR的方法測定骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因的mRNA水平的表達。GRM4基因蛋白表達的測定：通過Western Blot(WB)的方法測定骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因的蛋白水平的表達。統(tǒng)計學分析：應用SPSS 16(IBM,Armonk,NY,USA)進行統(tǒng)計分析。采用獨立樣本t檢驗來比較骨肉瘤組織和癌旁組織的甲基化水平、基因表達和蛋白表達的差異。用斯皮爾曼相關性(Spearman correlation)檢測GRM4基因甲基化和基因表達之間的相關性。GRM 4甲基化水平與臨床病理特征(包括年齡,性別,階段,外科分期,病理組織學類型,位置,和轉移)之間的關系則用卡方檢驗或Fisher確切概率法。應用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗分析骨肉瘤患者的總生存期(OS)、無復發(fā)生存率(RFS)和無進展生存期(PFS),其中需要排除在末次隨訪仍然存活的患者。P值0.05,被認為有統(tǒng)計學意義。結果：在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4基因啟動子甲基化的情：通過焦磷酸測序的方法檢測GRM4基因啟動子甲基化狀態(tài)。在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中平均甲基化水平分別是3.79±0.83%和4.08±0.74%,其中P0.05。這說明相對于非腫瘤患者的骨組織而言,在骨肉瘤組織中GRM4基因啟動子表現(xiàn)為低甲基化。在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4 mRNA水平的表達情況：用RT-PCR的方法檢測骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4 mRNA水平的表達情況。在骨肉瘤組織中GRM4 mRNA的灰度值為1.71±0.15,而在正常骨組織中其值為0.56±0.13,P0.05,有統(tǒng)計學意義。其結果表明與非腫瘤患者的骨組織中相比,在骨肉瘤組織中GRM4mRNA呈現(xiàn)高表達。在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4蛋白水平的表達情況：用免疫印跡分析方法(WB)的方法檢測骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中GRM4蛋白水平的表達情況。在骨肉瘤組織中的值為1.28±0.08,而在正常骨組織中其值為0.35±0.05,P0.05,有統(tǒng)計學意義。其結果表明與非腫瘤患者的骨組織中相比,在骨肉瘤組織中GRM4蛋白呈現(xiàn)高表達。通過斯皮爾曼相關性(Spearman correlation)檢驗發(fā)現(xiàn)GRM4基因的甲基化與其表達之間有一個顯著的負相關(r=-0.211,P=0.016)。GRM4甲基化水平與臨床病理參數的關系：根據GRM4基因甲基化狀態(tài),將甲基化水平四等分：Q1(≥4.51,n=16),Q2(3.34-4.51,n=16),Q3(3.04-3.34,n=15)以及Q4(≤3.04,n=16)。分析GRM4甲基化水平與臨床病理參數的關系,其結果表明GRM4甲基化水平與腫瘤轉移(P0.05)和復發(fā)(P0.05)密切相關,但是與年齡,性別,Enneking分期、病理類型及腫瘤位置不相關(所有P0.05)。生存分析：我們設定Q4為低甲基化組,而Q1、Q2和Q3作為高甲基化組。應用Kaplan-Meier分析和Log-rank檢驗分析骨肉瘤患者的總生存期(OS)、無復發(fā)生存率(RFS)和無進展生存期(PFS)。分析結果表明,相對于低甲基化組而言,高甲基化組有更長的平均生存時間(OS),P0.05。同樣的,無復發(fā)生存時間(RFS),P0.05和無進展生存期(PFS)的分析中,高甲基化組有更長的生存時間,P0.05。結論：(1)在骨肉瘤組織及非腫瘤患者的骨組織中平均甲基化水平的測定說明相對于非腫瘤患者的骨組織中而言,在骨肉瘤組織中GRM4基因表現(xiàn)為低甲基化。(2)RT-PCR結果表明與非腫瘤患者的骨組織中相比,在骨肉瘤組織中GRM4 mR NA呈現(xiàn)高表達。(3)免疫印跡分析方法(WB)結果表明與非腫瘤患者的骨組織中相比,在骨肉瘤組織中GRM4蛋白呈現(xiàn)高表達。(4)GRM4甲基化水平與臨床病理參數的結果表明GRM4甲基化水平與腫瘤轉移和復發(fā)密切相關。(5)生存分析結果表明,相對于低甲基化組而言,高甲基化組有更長的平均生存時間。同樣的,無復發(fā)生存率(RFS)和無進展生存期(PFS)的分析中,高甲基化組有更長的生存時間。
【關鍵詞】：骨肉瘤 代謝型谷氨酸受體4(mGluR4) mRNA表達 蛋白表達 低甲基化 預后
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 個人簡歷3-5
• 英文縮略詞5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-19
• 材料和方法19-37
• 統(tǒng)計學分析37-38
• 結果38-45
• 討論45-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-59
• 綜述59-77
• 參考文獻69-77
• 致謝77-78
• 攻讀學位期間成果78

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1 蔣騰龍;骨肉瘤中GRM4基因表達和啟動子甲基化的研究及其臨床意義[D];廣西醫(yī)科大學;2016年

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