本文關鍵詞：MANF參與缺氧預處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內質網應激的實驗研究

  更多相關文章： 創(chuàng)傷性顱腦損傷 MANF 缺氧預處理 CHOP 內質網應激

【摘要】：在目前常規(guī)武器戰(zhàn)爭中,參戰(zhàn)人員會身負的大量戰(zhàn)傷,顱腦損傷為戰(zhàn)爭時及戰(zhàn)后最致命性的損傷。創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后有多種繼發(fā)性損害,其中尤以細胞凋亡為特征的一些改變將會顯著影響病情的轉歸。內質網應激反應/敏感蛋白MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor)能夠增強細胞對多種不利因素如無糖狀態(tài)以及其它內質網應激誘因等的耐受性,通過調控內質網應激感受器的活性來改善細胞生理狀態(tài),從而減少細胞凋亡。研究MANF在創(chuàng)傷性顱腦損傷后的動態(tài)表達變化以及其干預措施也許會成為改善創(chuàng)傷性顱腦損傷預后的新的臨床切入點。第一部分MANF在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后皮質表達變化的實驗研究目的研究MANF在創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠腦皮質的動態(tài)表達變化;探究MANF在顱腦損傷后細胞凋亡病理過程中的作用;方法108只Sprague-Dawley雄性大鼠,體質量:230~280g,由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供,按照隨機數字表法分為顱腦損傷TBI組(n=96)和對照Con組(n=12),TBI組采用Feeney’s自由落體撞擊法構建模型,對照組不予處理。于傷后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d八個不同時間點處死大鼠,選取大鼠挫傷區(qū)周圍皮質腦組織,采用RT-q PCR、和Western blot檢測不同時間點選取的標本組織中MANF m RNA及其蛋白的動態(tài)表達變化;采用免疫組化染色檢測MANF在挫傷區(qū)周圍皮層腦組織中的分布并測定其累積光密度值;結果rt-PCR結果:皮質中MANF m RNA表達量在TBI后1h升高,6h達到高峰值,隨即開始下降,14d時表達回歸至正常水平,除14d外各時間點TBI組表達均高于Con組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),MANF免疫組化染色結果提示其蛋白陽性表達呈棕褐色或棕黃色,定位在胞質,TBI后1h胞質中即出現棕褐色或棕黃色顆粒,6h最明顯,之后各時間點胞質顏色逐漸淡染,14d時切片與Con組無差異。Western-blot及免疫組化法檢測的MANF蛋白結果:TBI后1h開始升高,6h達到高峰值,14d時表達回歸至正常水平,除14d外各時間點TBI組表達均高于Con組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);結論顱腦損傷后MANF陽性表達定位在胞質;MANF m RNA及其蛋白升高可能與細胞在顱腦損傷時激活一種內源性神經保護機制有關,MANF可能參與減少顱腦損傷后內質網應激途徑介導的細胞凋亡。第二部分MANF參與缺氧預處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內質網應激的實驗研究第一節(jié):缺氧預處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內質網應激的影響目的探討缺氧預處理(HPC)對創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)大鼠腦皮質促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)表達、神經元凋亡及神經功能的影響。方法健康SD雄性大鼠48只按隨機數字表法分為HPC組(給予HPC模型制作)和未HPC組(不予HPC預處理),每組24只;然后進一步分別按隨機數字表法分為對照組(不做任何處理)及TBI后1 d、3 d、7 d組(給予TBI模型制作,按照TBI后不同時間點觀察、處死并取材),每組6只。再另取SD大鼠48只,按上述方式分組,用于進行m NSS評分及灌注后取腦用,大鼠在低壓氧倉中進行每天3 h、連續(xù)3 d訓練以給予HPC,采用改良的Freeny’s法制作TBI模型。對各組大鼠進行神經功能嚴重程度評分(m NSS),q RT-PCR及Western blotting檢測挫傷區(qū)周圍皮質CHOP m RNA及蛋白表達,TUNEL法檢測神經元凋亡情況,統(tǒng)計學方法分析CHOP表達水平與神經元凋亡指數的相關性。結果TBI 1 d、3 d、7 d組大鼠m NSS評分、CHOP m RNA和蛋白相對表達量、神經細胞凋亡指數較對照組均明顯增高,并在傷后3 d時達到高峰值,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);并且,HPC組m NSS評分、CHOP m RNA和蛋白相對表達量、神經細胞凋亡指數均顯著低于未HPC組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。HPC組和未HPC組中TBI 1 d、3 d、7 d組CHOP表達與神經細胞凋亡指數呈正相關(Pearson系數分別為0.957、0.966)。結論HPC通過下調ERS途徑中CHOP的表達以減少神經元凋亡,從而改善神經功能。第二節(jié):缺氧預處理對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠MANF表達的影響目的通過觀察缺氧預處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后挫傷區(qū)周圍MANF和CHOP的動態(tài)表達變化的影響,探究MANF參與缺氧預處理減輕大鼠顱腦損傷后內質網應激的機制。方法108只Sprague-Dawley雄性大鼠,按照隨機數字表法分為缺氧預處理組和未進行缺氧預處理組,每組54只,然后進一步按隨機數字表法分為對照組及TBI后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d組(TBI模型制作完成后于對應的時間點處死大鼠),每亞組各6只。缺氧預處理組大鼠在低壓氧倉(-50k Pa)中進行連續(xù)3天、每天持續(xù)3小時進行造模;TBI造模方法同第一部分,HPC結束后1d行TBI打擊,造模結束后各亞組中大鼠直接處死,留取腦組織保存于液氮罐中用于行rt-PCR及Western-blot檢測。結果MANF m RNA及其蛋白在顱腦損傷后1h就開始上調,傷后6h達到高峰值,之后開始下降,傷后7d時仍高于對照組,傷后14d時回歸到正常水平,相鄰亞組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);CHOP m RNA及其蛋白在傷后1h就開始增高,傷后3d才達高峰值,之后開始下降,到傷后7d時表達仍高于對照組,傷后14d時回歸到正常水平,相鄰亞組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。HPC組大鼠傷后1h-7d各時間點MANF m RNA及其蛋白相對表達量均高于未HPC組,HPC組大鼠傷后1h-7d各時間點CHOP m RNA及其蛋白相對表達量均低于未HPC組(均P0.05)。對照組間比較:Con組與HPC組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論缺氧預處理可使MANF表達增多,減少內質網應激途徑中CHOP表達,減少神經細胞凋亡。
【關鍵詞】：創(chuàng)傷性顱腦損傷 MANF 缺氧預處理 CHOP 內質網應激
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照表6-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-18
• 第一部分MANF在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后皮質表達變化的實驗研究18-35
• 1.材料與方法18-29
• 2.實驗結果29-32
• 3.討論32-34
• 4.結論34-35
• 第二部分MANF參與缺氧預處理減輕大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內質網應激的實驗研究35-50
• 第一節(jié)：缺氧預處理對大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后內質網應激的影響35-45
• 1.材料與方法35-40
• 2.結果40-43
• 3.討論43-45
• 第二節(jié)：缺氧預處理對創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠MANF表達的影響45-50
• 1.材料與方法45
• 2.結果45-47
• 3.討論47-49
• 4.結論49-50
• 全文總結50-51
• 參考文獻51-54
• 附錄54-55
• 致謝55-56
• 綜述56-62
• 參考文獻61-62

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