本文關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在X-連鎖遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良發(fā)病機制中的作用

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【摘要】：目的:采用慢病毒介導(dǎo)的LV-siSEDL沉默人軟骨細胞(HC-a)中SEDL基因的表達,觀察SEDT細胞模型中是否有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的產(chǎn)生及其信號通路激活情況,初步探索ERS在SEDT發(fā)病機制中的作用。方法:實驗分為3組:空白對照組(加PBS的HC-a)、LV-組(轉(zhuǎn)染空載慢病毒的HC-a)、LV組(轉(zhuǎn)染干擾慢病毒LV-siSEDL的HC-a)。(1)不同濃度(0-10ug/ml)的嘌呤霉素(Puro)作用于人軟骨細胞(HC-a)12h、24h、48h、72h和96h,采用最小抗生素濃度的Puro篩選轉(zhuǎn)染慢病毒的細胞株。(2)QPCR、Western Blot分別檢測SEDL mRNA、Sedlin蛋白表達水平,確定SEDT細胞模型是否建立成功。(3)QPCR檢測ERS信號通路上相關(guān)應(yīng)激信號分子mRNA表達水平,觀察基因水平上是否有ERS產(chǎn)生及信號通路隨時間的激活情況。(4)根據(jù)QPCR的結(jié)果,采用Western Blot從蛋白水平上驗證是否有ERS產(chǎn)生及信號通路隨時間的激活情況。(5)采用Annexin-FITC/PI雙染法檢測HC-a的凋亡率。結(jié)果:(1)確定puro72h殺死所有hc-a的最小抗生素濃度為5ug/ml。(2)病毒轉(zhuǎn)染4天,lv組sedlmrna及sedlin蛋白相對表達量分別為(0.27±0.02)、(0.05±0.01),與lv-組及空白對照組相比顯著下調(diào)(p0.001),成功構(gòu)建了sedt細胞模型。(3)病毒轉(zhuǎn)染4天,lv組各應(yīng)激信號分子mrna相對表達量與lv-組及空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);病毒轉(zhuǎn)染5天,lv組xbp-1、atf-6mrna相對表達量分別為(2.25±0.17)、(1.40±0.08),與lv-組及空白對照組相比明顯上調(diào)(p0.05);病毒轉(zhuǎn)染6天,lv組grp78、atf-4、chopmrna相對表達量分別為(1.75±0.16)、(1.82±0.14)和(2.73±0.21),與lv-組及空白對照組相比顯著上調(diào)(p0.01)。而lv組nfkbia、nfkb-1及relamrna相對表達量與lv-組及空白對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。(4)病毒轉(zhuǎn)染4天,lv組grp78蛋白相對表達量為(3.09±0.09),與lv-組及空白對照組相比明顯上調(diào)(p0.001),隨后逐漸下降;病毒轉(zhuǎn)染6天,lv組atf-4蛋白相對表達量為(0.61±0.03),與lv-組及空白對照組相比顯著上調(diào)(p0.001);而chop蛋白相對表達量隨著病毒轉(zhuǎn)染時間的延長逐漸上調(diào),且lv組chop蛋白相對表達量與lv-組及空白對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。(5)病毒轉(zhuǎn)染6天,與lv-組(4.60±0.23)%及空白對照組(3.89±0.15)%相比,lv組凋亡率(9.78±0.56)%顯著上調(diào)(p0.05)。結(jié)論:初步證實SEDT細胞模型中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)的發(fā)生,而且是通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)中的PERK/eIF2α/ATF-4信號通路,最終誘導(dǎo)HC-a凋亡在SEDT的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：SEDL Sedlin 軟骨細胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R726.8
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 1 材料13-18
• 2 方法18-26
• 3 結(jié)果26-36
• 4 討論36-39
• 5 結(jié)論39-40
• 全文總結(jié)40-41
• 參考文獻41-43
• 文獻綜述43-54
• 參考文獻50-54
• 致謝54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文55

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