骨肉瘤是原發(fā)性骨癌最常見的組織學(xué)形式,標(biāo)準(zhǔn)療法是在患者身上使用藥物治療,然后采取截肢手術(shù)。在骨肉瘤治療過程中有不少患者會逐漸對化療產(chǎn)生耐藥甚至?xí)霈F(xiàn)多藥耐藥的現(xiàn)象從而導(dǎo)致治療的失敗,因此,對骨肉瘤耐藥機制的研究有助于通過避開和逆轉(zhuǎn)耐藥治療靶點的方法來提高治療效果和預(yù)后。本研究通過構(gòu)建siRNA和抗癌藥物的有效共遞體系,找到影響藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵基因,從而利用其可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的死亡,同時抑制藥物抗性的發(fā)生。在研究中我們采用了能夠覆蓋人的3萬個基因的siRNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)染,再加上藥物刺激,獲得了具有耐化療藥物Nutlin3a的骨肉瘤細(xì)胞。然后由高通量測序找出了富集siRNA片段,分別或者組合轉(zhuǎn)染使細(xì)胞獲得耐藥能力,再檢測并對比了不同siRNA片段轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)重要基因的表達(dá)變化,最終找到了骨肉瘤細(xì)胞耐nutlin 3a的關(guān)鍵基因和潛在靶點。研究主要分為以下幾個部分:(1)應(yīng)用全基因組siRNA文庫質(zhì)粒刺激骨肉瘤細(xì)胞SJSA1,獲得了具有耐藥特性的n19-SJSA1-Nutlin3a細(xì)胞株。Nutlin3a對SJSA1親代細(xì)胞的致死劑量是4μM,而我們構(gòu)建的穩(wěn)定耐藥細(xì)胞株能承受40μM的N...

【文章頁數(shù)】：165 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖1.1NEBGibsonDNAAssembly原理示意圖

1緒論到骨架質(zhì)粒上，從而構(gòu)建了覆蓋了人的全基因組siRNA文庫逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒。通過質(zhì)粒的構(gòu)建，克隆生長計數(shù)，菌落PCR及陽性質(zhì)粒的測序，驗證得到文庫一次GibsonAssembly可以形成1.8×107個克隆數(shù)，并且發(fā)現(xiàn)插入片段具有明顯的隨機性和異質(zhì)性。

圖1.3Molab單次合成的siRNA文庫的克隆數(shù)Figure1.3BacterialcolonscountingofthesiRNAlibraryfromMolab

圖1.2MolabsiRNA文庫質(zhì)粒的基礎(chǔ)圖Figure1.2TheplasmidofsiRNAlibraryfromMolab文庫質(zhì)粒的覆蓋面siRNA文庫能夠覆蓋人的3萬個基因，通過它可以篩查哪些基因在腫瘤的及發(fā)展中具有決定性的作用，從而誘導(dǎo)腫瘤....

圖1.4MolabsiRNA文庫質(zhì)粒的菌落PCR及測序Figure1.4BacterialPCRandsequencingdataofsiRNAlibraryplasmidfromMolab

1緒論樣性的菌落除了計數(shù)外，還要進(jìn)行PCR鑒定，如下圖構(gòu)建的siRNA文庫質(zhì)粒的陽性率可以達(dá)到90%性結(jié)果進(jìn)行檢驗測序，發(fā)現(xiàn)每一條siRNA的序樣性，符合我們預(yù)期擬構(gòu)建能夠覆蓋人的3萬個

圖1.5實驗技術(shù)路線圖

圖1.5實驗技術(shù)路線圖Figure1.5Thetechnologyroutemapofexperiment1.4課題的特色及創(chuàng)新點①將隨機且特異性覆蓋人基因組的siRNA文庫用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方式導(dǎo)入骨肉瘤SJSA1細(xì)胞株中，在短時間內(nèi)通過Nutlin....

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