長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一種由RNA聚合酶Ⅱ指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄形成的一類長度大于200bp而小于100kb的RNA分子。轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA Lnc247為Foxk1的天然反義LncRNA。Foxk1基因在調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化方面具有重要作用,因此,研究Lnc247的功能可為揭示lncRNA在骨骼肌損傷修復(fù)中的調(diào)控作用提供依據(jù)。本論文采用分子生物學(xué)、組織化學(xué)、轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)分析等多種研究手段,圍繞Lnc247對骨骼肌再生過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Foxk1的作用及對骨骼肌損傷修復(fù)的影響進行了研究。1.用高性能的可視化工具——整合基因組瀏覽器(Integrative Genomics Viewer IGV)和UCSC的BLAT功能分析發(fā)現(xiàn)Lnc247與Foxk1的部分3′UTR區(qū)域反向互補,表明Lnc247為Foxk1的天然反義lncRNA。2.采用腺病毒相關(guān)病毒(AAV)在脛骨前肌中過表達Lnc247,Western Blot結(jié)果顯示,Foxk1的蛋白水平顯著低于對照組,表明過表達Lnc247對Foxk1基因的表達具有負調(diào)控作...

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 骨骼肌概述
        1.1.1 骨骼肌在畜牧業(yè)中的應(yīng)用
        1.1.2 骨骼肌對人類生命活動的影響
        1.1.3 肌衛(wèi)星細胞的發(fā)現(xiàn)和作用
    1.2 LncRNA概述
        1.2.1 LncRNA簡介
        1.2.2 LncRNA在癌癥中的作用
        1.2.3 LncRNA在神經(jīng)退行性疾病中的作用
        1.2.4 LncRNA的靶基因Foxk1 簡介
    1.3 LncRNA在骨骼肌發(fā)生過程中的作用
        1.3.1 與染色質(zhì)相互作用調(diào)控骨骼肌分化
        1.3.2 與蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控骨骼肌分化
        1.3.3 與其他RNA相互作用調(diào)控骨骼肌分化
    1.4 LncRNA與其編碼的微肽對骨骼肌的調(diào)控
    1.5 在骨骼肌疾病中的作用
        1.5.1 LncRNA與 DMD
        1.5.2 LncRNA與 FSHD
        1.5.3 LncRNA與骨骼肌肥大性疾病
        1.5.4 LncRNA與肌萎縮側(cè)索硬化癥
    1.6 與LncRNA有關(guān)的臨床治療方法
        1.6.1 腺病毒和慢病毒治療途徑
        1.6.2 反義寡核苷酸治療
    1.7 本論文研究意義
第二章 實驗動物與耗材
    2.1 實驗動物
    2.2 實驗耗材與試劑
    2.3 實驗設(shè)備與儀器
    2.4 抗體信息
    2.5 引物信息
第三章 實驗方法與步驟
    3.1 麻醉劑的配制
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 麻醉步驟
    3.2 基因表達量的分析
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 小鼠組織總RNA的提取
        3.2.3 反轉(zhuǎn)錄RNA
        3.2.4 PCR反應(yīng)
        3.2.5 qPCR反應(yīng)
    3.3 確定AAV的合適注射劑量
        3.3.1 主要試劑
        3.3.2 注射方法
        3.3.3 腺相關(guān)病毒載體(血清型:8 型)
        3.3.4 SiRNA信息
    3.4 組織石蠟切片和H&E染色
        3.4.1 主要試劑
        3.4.2 組織石蠟切片
        3.4.3 H&E染色步驟
    3.5 蛋白表達量分析
        3.5.1 主要試劑
        3.5.2 細胞總蛋白的提取
        3.5.3 蛋白濃度的測定
        3.5.4 WB操作步驟
    3.6 小鼠過表達損傷模型的構(gòu)建
        3.6.1 主要試劑
        3.6.2 構(gòu)建步驟
    3.7 測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
        3.7.1 不同處理情況樣本無監(jiān)督聚類
        3.7.2 差異表達基因GO功能注釋和KEGG通路分析
第四章 實驗結(jié)果
    4.1 Lnc247與Foxk1 基因的關(guān)系
        4.1.1 Lnc247 序列信息
        4.1.2 Lnc247為Foxk1 天然反義LncRNA
    4.2 Lnc247與Foxk1 基因在小鼠體內(nèi)表達情況
        4.2.1 Lnc247 的蛋白編碼能力分析結(jié)果
        4.2.2 Lnc247和Foxk1 在小鼠肌肉組織中的表達情況
    4.3 Lnc247 過表達與敲低的腺相關(guān)病毒感染脛骨前肌
        4.3.1 過表達Lnc247 病毒感染脛骨前肌結(jié)果
        4.3.2 敲低Lnc247 病毒感染脛骨前肌后總RNA的提取
        4.3.3 敲低Lnc247 病毒感染后總RNA反轉(zhuǎn)錄結(jié)果
        4.3.4 敲低Lnc247 病毒感染脛骨前肌結(jié)果
    4.4 重金屬離子對小鼠脛骨前肌的損傷
    4.5 過表達Lnc247 抑制Foxk1 基因的表達
    4.6 過表達Lnc247 促進肌衛(wèi)星細胞的肌源性分化
    4.7 過表達Lnc247 促進受損肌纖維的修復(fù)
        4.7.1 損傷修復(fù)第三天過表達組e-MHC表達量升高
        4.7.2 損傷修復(fù)第七天過表達組e-MHC表達量降低
        4.7.3 過表達損傷組再生肌纖維面積比對照組大
    4.8 RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的初步分析
        4.8.1 測序樣本名稱及意義
        4.8.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測測序樣本質(zhì)量
        4.8.3 無監(jiān)督聚類分析
        4.8.4 GO基因功能富集分析和KEGG通路分析
第五章 結(jié)論與展望
致謝
參考文獻
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號：3830673