[目的]構(gòu)建恒河猴反義miR-155（Micro RNA-155,微小RNA-155）慢病毒載體并鑒定,誘導(dǎo)并培養(yǎng)恒河猴未成熟的樹突狀細(xì)胞,用重組的反義miR-155慢病毒載體轉(zhuǎn)染恒河猴未成熟樹突狀細(xì)胞,PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測miR-155在恒河猴未成熟樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)。[方法]1.將慢病毒載體酶切,與目的基因的退火雙鏈DNA連接,其產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)。將培養(yǎng)出的載體進(jìn)行測序。包裝慢病毒載體,經(jīng)濃縮純化后,使用藥篩法測定病毒滴度。2.使用恒河猴外周血,通過加入細(xì)胞因子GM-CSF（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor,粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）（1 OOng/ml）、IL-4（Interleukin-4,白細(xì)胞介素-4）（50ng/ml）體外誘導(dǎo)并培養(yǎng)恒河猴未成熟的樹突狀細(xì)胞,通過流式細(xì)胞儀及掃描電鏡進(jìn)行免疫表型鑒定及超微結(jié)構(gòu)觀察。3.用重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染恒河猴的未成熟樹突狀細(xì)胞,RT-qPCR（Real-time Quantitative Polymera... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．ＧＶ２８０載體圖譜??

ＨＥＫ－２９３細(xì)胞完全培養(yǎng)基］ｍｌ，吹勻后使得細(xì)胞可以懸浮，隨后將其放入含有二??氧化碳濃度為二十分之一，溫度３７°Ｃ的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一天后更換ＨＥＫ－２９３細(xì)??胞完全培養(yǎng)基，隨后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。??ＨＥＫ－２９３細(xì)胞的傳代??ＨＥＫ－２９３細(xì)胞匯合度到達(dá)十分之八到十分之九間進(jìn)行傳代。??拋棄ＨＥＫ－２９３細(xì)胞完全培養(yǎng)基，隨后在６孔板上滴入５ｍｌ滅菌ＰＢＳ液體洗??滌細(xì)胞生長面，隨后丟棄該液體。??加入濃度為０．２５％的胰蛋白酶消化液ｌｍｌ，隨后輕晃６０秒到１２０秒，使得??細(xì)胞脫落下來，隨后再加入５ｍｌ?ＨＥＫ－２９３細(xì)胞完全培養(yǎng)基，并用刻度吸管吹打??幾次，可以使得瓶壁的細(xì)胞得到完全沖洗。??２．２．２質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與慢病毒載體收獲??Ｑｉａｇｅｎ公司的質(zhì)粒抽提試劑盒中提取到的慢病毒質(zhì)粒ＤＮＡ有三種，為了測??試其純度，將其置于溶于除菌的ＴＥ緩沖液中，用紫外光吸收法測量，得出所提??取的質(zhì)粒?ＤＮＡＡ２６０／Ａ２８０?介于?１．８－２．０。??病毒包裝輔助質(zhì)粒ｐＨｅｌｐｅｒ?１．０載體圖譜：??ｋ?＾＼Ｐ〇??占廠Ｉ?Ｈｅｌｐｅｒｌ?．０?１?＼??ＫＪ??ａｕＢ?ＲＲＥ??圖２．?ｐＨｅｌｐｅｒｌ．Ｏ輔助質(zhì)粒載體圖譜??１８??

病毒包裝輔助質(zhì)粒ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０載體圖譜：??〇／?Ｈｅｌｐｅｒ２．０?＼??ｉ?５．８?ｋｂ?！??Ｗ??圖３．?ｐＨｅｌｐｅｒ２．０輔助質(zhì)粒載體圖譜??在轉(zhuǎn)染開始前２４小時，用含有十分之一胎牛血清的培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整??為ｘｌＯ６細(xì)胞／１５ｍｌ，與此同時，用胰蛋白酶對對數(shù)生長期的ＨＥＫ－２９３細(xì)胞進(jìn)行??消化，其后，將其重新接種在１０ｃｍ細(xì)胞培養(yǎng)皿，最后將其放置于溫度為３７°Ｃ’??二氧化碳濃度為二十分之一的培養(yǎng)箱內(nèi)，待整一天后細(xì)胞密度處于７０％到８０％??的區(qū)間可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。??轉(zhuǎn)染前２ｈ更換為無血清培養(yǎng)基。??為了形成轉(zhuǎn)染混合液，向滅菌離心管內(nèi)加入ＧＶ２８０載體質(zhì)粒２０噸、ＰＨｅｌＰｅｒ??１．０載體質(zhì)粒１５呢、ｐＨｅｌｐｅｒ?２．０載體質(zhì)粒丨〇ｆｉｇ的ＤＮＡ溶液，并將其與??Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００轉(zhuǎn)染試劑混合，使得體積為１ｍｌ，在常溫下培育１５分鐘可??得。??在溫度為３７°Ｃ，二氧化碳濃度為二十分之一環(huán)境下，將ＤＮＡ和??Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ?２０００混合液置于ＨＥＫ－２９３細(xì)胞的培養(yǎng)液中培育。??經(jīng)過６小時的培養(yǎng)丟棄含有混合液的培養(yǎng)基，并加入ＰＢＳ液ｌ〇ｍｌ進(jìn)行清洗，??輕晃器皿以洗凈殘余混合液。??在溫度為３７°Ｃ，二氧化碳濃度為二十分之一溫箱中加入含有十分之一的胎??牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基２０ｍｌ，，培養(yǎng)４８ｈ。??１９??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]B cells with regulatory properties in transplantation tolerance[J]. Justine Durand,Elise Chiffoleau.  World Journal of Transplantation. 2015(04)
[2]肝移植術(shù)后中長期管理應(yīng)注意的問題[J]. 竇科峰,張毅.  臨床外科雜志. 2009 (09)
[3]當(dāng)前肝移植外科應(yīng)注意的問題[J]. 夏穗生.  中華肝膽外科雜志. 2003(05)



本文編號：3502511