[目 的]明確新近發(fā)現(xiàn)的E3泛素連接酶RNF165基因在乳腺癌的表達和功能,為乳腺癌防治奠定基礎(chǔ)。[方法]1、運用Ualcan和BCIP數(shù)據(jù)庫對RNF165在乳腺癌中的表達及其與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系進行初步分析。2、利用從2株人永生化乳腺上皮細胞和12株人乳腺癌細胞中提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,通過qPCR檢測乳腺癌細胞中RNF165在mRNA水平的表達。3、構(gòu)建RNF165野生型（RNF165WT）及其酶活突變體RNF165C294/297A 和 RNF165M313A 質(zhì)粒,制備慢病毒。4、利用HCC1806和MDA-MB-231乳腺癌細胞構(gòu)建穩(wěn)定過表達RNF165WT 和其酶活突變體 RNF165C294/297A、RNF165M313A 的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株5、在穩(wěn)定表達RNF165WT及其酶活突變體RNF165C294/297A和RNF165M313A的HCC1806和MDA-MB-231乳腺癌細胞中進行SRB實驗、細胞劃痕實驗、Tanswell實驗和流式細胞術(shù),檢測過表達RNF165對細胞生長、遷移、侵襲和周期的影響。[結(jié) 果]1、Ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示RNF165 mRNA在乳腺原... 

【文章來源】：昆明醫(yī)科大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＲＮＦ１６５在乳腺癌中的表達及其與乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系

１．２?ＲＮＦ１６５?ｍＲＮＡ在乳腺癌細胞中主要呈低表達??鑒于數(shù)據(jù)庫信息提示ＲＮＦ１６５在乳腺癌中可能扮演抑癌基因的角色，我們進一??步在乳腺癌細胞中檢測了?ＲＮＦ１６５的表達。因為ＲＮＦ１６５抗體檢測內(nèi)源ＲＮＦ１６５蛋??白表達的效果不好，我們通過ｑＰＣＲ檢測了?ＲＮＦ１６５?ｍＲＮＡ在乳腺癌細胞中的相對??表達量，結(jié)果提示ＲＮＦ１６５在人乳腺細胞中ｍＲＮＡ水平的表達（獲得的實驗數(shù)據(jù)??先標(biāo)準(zhǔn)化至內(nèi)參ＧＡＰＤＨ，再以ＭＣＦ１０Ａ作為對照）以相對正常的乳腺上皮細胞??ＭＣＦ１０Ａ、１８４Ｂ５?和乳腺癌細胞?ＨＣＣ１５００?相對較高，而在?ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＨＳ５７８Ｔ、??Ｔ４７Ｄ和ＳＫ－ＢＲ－３乳腺癌細胞中未檢測到ｍＲＮＡ水平的表達，在其余７株乳腺癌??細胞中表達相對較低（圖２）。??６－??〇??Ｉ?Ａ??＾?４－??Ｚ?Ｉ??ＣＣ．?Ｍ??Ｅ?ｉ?ａ??５８?２．?１?Ｅ??圖２?ＲＮＦ１６５在人乳腺癌細胞中ｍＲＮＡ水平的相對表達量。共收集了?１４株人乳腺細胞，包??括２株永生化的乳腺上皮細胞和１２株乳腺癌細胞，提取其ＲＮＡ，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得ｃＤＮＡ，再??以ｃＤＮＡ為模板進行ｑＰＣＲ檢測ＲＮＦ１６５?ｍＲＮＡ水平的相對表達量。??２?ＲＮＦ１６５在乳腺癌中的功能??為了明確ＲＮＦ１６５在乳腺癌中的功能，我們構(gòu)建了?ＰＣＤＨ－ＲＮＦ１６５ＷＴ表達??質(zhì)粒，因為ＲＮＦ１６５是一個Ｅ３泛素連接酶，其發(fā)揮功能可能是依賴其Ｅ３泛素??２８??

?Ｗ?？＞??＾?Ｎ?＇?＾?Ｖ?＾?—??Ｄａｙ＊??Ｃ?Ｄ??ＨＣＣ１８０６?ＭＤＡ－ＭＢ－２３１??＿?Ｒ＾１６５Ｍ３１３Ａ?Ｗ?—?ＲＮＦ１８５Ｍ３１３Ａ??９－?ｉ?ＲＮＦ１６５ＷＴ?４０－?—?ＲＮＦ１０５ＷＴ??３?３０?／?—?ＰＣＯＨ?５?＾?—?ＰＣＯＨ??卜?ｆ：?Ｘ??〇］?．?—．?．?．?ｒ—?〇?？?＂Ｔ?￣．?．?．?．—??＾?＼?＊Ｖ?Ｖ?ｔ＞?＾?Ｎ?＊Ｖ??Ｄａｙｓ?Ｄａｙｓ??圖４過表達ＲＮＦ１６５ＷＴ能夠抑制乳腺癌細胞ＨＣＣ１８０６和ＭＤＡ－ＭＢ－２３１的生長。（Ａ和Ｂ）??穩(wěn)定過表達ＲＮＦ１６５ＷＴ和酶活突變體ＲＮＦ１６５Ｃ２９４／２９７Ａ對細胞生長的影響。（Ｃ和Ｄ）穩(wěn)??定過表達ＲＮＦ１６５ＷＴ和酶活突變體ＲＮＦ１６５Ｍ３１３Ａ對細胞生長的影響。將穩(wěn)定過表達??ＲＮＦ１６５ＷＴ?組、ＲＮＦ１６５Ｃ２９４／２９７Ａ?組、ＲＮＦ１６５Ｍ３１３Ａ?組和?ＰＣＤＨ?對照組的?ＨＣＣ１８０６??（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）細胞等量接種于４８孔板，每組細胞每個時間點鋪３個復(fù)孔，分別于鋪板??３０??


本文編號：3466050