目的:通過建立靶向線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（Mitochondrial Transcription Factor A,TFAM）和核呼吸因子1（Nuclear Respiratory Factor-1,NRF-1）的基因沉默（RNA interference,RNAi）大鼠入肝血流阻斷模型,觀察促肝細(xì)胞生長素（Promoting Hepatocyte Growth Factor,PHGF）在RNAi大鼠肝細(xì)胞內(nèi)是否有保護(hù)作用,初步研究PHGF是否通過調(diào)控TFAM和/或NRF-1影響線粒體DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）合成,進(jìn)而保護(hù)肝細(xì)胞線粒體功能。方法:第一步建立靶向NRF-1和TFAM的RNAi大鼠模型。設(shè)計(jì)RNAi模板序列,采用化學(xué)合成的方法合成小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）;利用lipofectamin2000轉(zhuǎn)染siRNA至HSC-T6細(xì)胞,利用Real Time PCR及Western blot檢測(cè)RNAi效果,根據(jù)結(jié)果篩選出最佳干擾效果siRNA;將最佳抑制活性的RNAi序列進(jìn)行慢病毒包裝;將慢病毒顆粒經(jīng)大鼠尾靜脈注... 

【文章來源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

siRNA轉(zhuǎn)染后HSC-T6細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察情況（標(biāo)尺=100μm）

2.1.5 兩條有效干擾序列進(jìn)行慢病毒包裝成功后，進(jìn)行大鼠活體RNAi實(shí)驗(yàn)，病毒感染大鼠肝臟后，取新鮮肝臟組織做冰凍病理切片，熒光顯微鏡下觀察到肝組織中存在帶綠色熒光慢病毒（圖6）。圖6 肝組織感染慢病毒后可見綠色熒光（×200）2.1.6 RT-PCR檢測(cè)靶基因相對(duì)表達(dá)量（表11、表12）：LV3-TFAM組、LV3-NRF-1組與陰性病毒對(duì)照組及正常細(xì)胞對(duì)照組相比，靶基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降，陰性對(duì)照與正常對(duì)照組無差異，病毒有效，大鼠活體RNAi成功。表11 大鼠肝組織TFAM mRNA相對(duì)表達(dá)量( x s，n=6)組別 靶基因average Ct β-actin average Ct 靶基因相對(duì)表達(dá)量LV3-TFAM組 21.21±0.26 15.61±0.09 0.41(0.33-0.49)*LV3-NC組 20.13±0. 24 15.73±0.21 0.93(0.75-1.16)CON組 20.15±0.18 15.85±0.13 1(0.86-1.16)注：靶基因相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt值表示，*與CON組比較， P＜0.05;

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 羅燕青27圖7 大鼠肝組織HE染色結(jié)果（200×）注：各圖所代表具體分組見下表所示：SD大鼠 靶向TFAM的RNAi大鼠 靶向NRF-1的RNAi大鼠實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組術(shù)后第1d a b c d e f術(shù)后第7d g h i j k l2.3 肝功能檢測(cè)情況：術(shù)后1d各組肝功能均明顯損害，ALT、AST、TB升高， 其中基因沉默組大鼠（B組、C組）較正常組大鼠（A組）ALT、AST、TB值更高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間無明顯差別；術(shù)后各組大鼠肝功能ALT、AST、TB值均有下降，術(shù)后第7d，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組ALT、AST、TB值下降更明顯。g h ij k l

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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