目的本文旨在將干細(xì)胞與抗菌肽優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,采用抗菌、免疫調(diào)節(jié)和感染創(chuàng)面修復(fù)綜合治療,為創(chuàng)面金黃色葡萄球菌感染的治療提供新方法。具體地說,本實(shí)驗(yàn)采用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUC-MSCs）作為種子細(xì)胞,將抗菌肽LL-37通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi),檢測(cè)抗菌肽LL-37在hUC-MSCs中的基因表達(dá)狀況,并證實(shí)經(jīng)轉(zhuǎn)染抗菌肽LL-37后的干細(xì)胞釋放出外分泌物質(zhì),其培養(yǎng)上清液對(duì)金黃色葡萄球菌具備較強(qiáng)的抑菌效應(yīng),目的是為臨床上有效治療、合理應(yīng)用非抗生素類的抗感染藥奠定理論基礎(chǔ)。方法1.采取組織分離法提取細(xì)胞后,傳代、凍存、復(fù)蘇等常規(guī)方法培養(yǎng)h UC-MSCs,每次換液時(shí)應(yīng)用倒置顯微鏡觀察所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)變化特點(diǎn)。2.將提取完成的hUC-MSCs應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定,檢驗(yàn)是否符合干細(xì)胞的細(xì)胞免疫表型。3.構(gòu)建和包裝慢病毒載體用于搭載抗菌肽LL-37基因,并且選用熒光法測(cè)定慢病毒的滴度值。4.選取處于對(duì)數(shù)生長期的hUC-MSCs進(jìn)行細(xì)胞分組,標(biāo)記為3組,進(jìn)行轉(zhuǎn)染攜帶抗菌肽LL-37慢病毒載體的hUC-MSCs標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組;進(jìn)行轉(zhuǎn)染未攜帶抗菌肽LL-37空載慢病毒載體的hUC-MSCs標(biāo)記為空載體組;未... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

過表達(dá)慢病毒克隆的制備過程簡述（1）先將載體進(jìn)行酶切、消化，收獲已經(jīng)線性化的載體先配制包含內(nèi)切酶Buffer、純化質(zhì)粒DNA等的酶切體系，用移液器吹打而后離

材料與方法9流程圖2利用293T細(xì)胞收獲慢病毒、包裝、檢測(cè)選用熒光法測(cè)定慢病毒的滴度：（1）首先，在滴度測(cè)定的前一天進(jìn)行鋪板，使用293T細(xì)胞鋪到96孔的孔板內(nèi)，每孔加入細(xì)胞數(shù)量約為4×104個(gè)，且為100μL體積；（2）準(zhǔn)備好滅菌的Ep管10個(gè),在各Ep管內(nèi)分別加入培養(yǎng)液90μL（此處不含血清）；（3）取出第1個(gè)滅菌的Ep管，管內(nèi)加入10μL待測(cè)定的病毒原液，混勻后，再取出第2個(gè)管，管內(nèi)加入10μL，以同樣的操作進(jìn)行下去，完成最后1個(gè)Ep管為止；（4）依據(jù)所需要的細(xì)胞選擇孔，棄掉孔內(nèi)90μL的培養(yǎng)液，把稀釋好的病毒液加入孔內(nèi)，體積為90μL，而后放置在培養(yǎng)箱里即可；（5）24h后，為避免細(xì)胞吹起，小心加入完全培養(yǎng)液100μL；（6）96h后，使用熒光顯微鏡觀察熒光狀況。2.4實(shí)驗(yàn)分組及轉(zhuǎn)染2.4.1實(shí)驗(yàn)分組選擇細(xì)胞并分組時(shí)，選取目前處于對(duì)數(shù)生長期的hUC-MSCs，PBS溶液洗滌2遍以后，使用0.25%胰酶（含EDTA）消化，時(shí)間約1min，而后加入同等體積的完全培養(yǎng)液終止，離心后，使用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，而且使用計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，按

青島大學(xué)碩士學(xué)位論文10照細(xì)胞密度5×107個(gè)/L接種于12孔板中，放置在溫度為37℃并且體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，培養(yǎng)至細(xì)胞融合密度約為30%，此時(shí)隨機(jī)分為3個(gè)組別，而且每個(gè)組設(shè)置為3個(gè)復(fù)孔。①進(jìn)行轉(zhuǎn)染攜帶抗菌肽LL-37慢病毒載體的hUC-MSCs標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組；②進(jìn)行轉(zhuǎn)染未攜帶抗菌肽LL-37空載慢病毒載體的hUC-MSCs標(biāo)記為空載體組；③未進(jìn)行轉(zhuǎn)染等特殊處置、常規(guī)換液培養(yǎng)的hUC-MSCs標(biāo)記為對(duì)照組。2.4.2轉(zhuǎn)染[15]方法根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果判斷，將病毒的滴度進(jìn)行稀釋，使滴度為1×1011TU/L便于操作，12孔板中每孔加入慢病毒30μL及感染增強(qiáng)液20μL，放置在溫度設(shè)為37℃并且體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待12~24h根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行換液，轉(zhuǎn)染時(shí)間長度達(dá)到72h后，為了清晰觀察慢病毒載體攜帶的綠色熒光(GFP)表達(dá)狀況可以使用熒光顯微鏡，當(dāng)觀察熒光率超過80%時(shí)表明此次轉(zhuǎn)染成功，否則，需要進(jìn)行重新轉(zhuǎn)染直到達(dá)標(biāo)為止。平均每3d進(jìn)行換液處理一次，并且待細(xì)胞達(dá)到85%~90%，可以傳代培養(yǎng)，使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。換液時(shí)，收集細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，并且按照15:1的比例用Ultra-15超濾管進(jìn)行濃縮，并且使用過濾器（0.22μm）將上清液進(jìn)行除菌，除菌完畢，將其保存至-80℃低溫冰箱，以備用于抑菌實(shí)驗(yàn)使用�？梢远啻芜M(jìn)行分組及轉(zhuǎn)染獲取各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，充足獲取以用于實(shí)驗(yàn)。2.5Westernblot方法檢測(cè)（見流程圖3）應(yīng)用Westernblot方法[16]進(jìn)行檢測(cè)各組別的抗菌肽LL-37蛋白表達(dá)情況，結(jié)果以LL-37蛋白條帶光密度/內(nèi)參光密度值表達(dá)。流程圖3通過Westernblot方法做LL-37蛋白水平的過表達(dá)檢測(cè)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3441835