目的:椎間盤退變（Intervertebral discdegeneration,IDD）是導(dǎo)致腰背痛的重要原因之一。相關(guān)研究表明,在IDD的病理性變化中活性氧分子增多,炎癥因子過表達及細胞外基質(zhì)丟失均是重要的誘因。阿司匹林（Aspirin）作為經(jīng)典的非甾體類消炎藥物之一,在臨床應(yīng)用中能夠有效緩解各類疼痛及炎癥。然而Aspirin能否通過減輕氧化應(yīng)激來改善IDD的進程,目前并不清楚。本實驗旨在研究Aspirin調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對IDD的影響及作用機制,從而提出新的治療策略。方法:無菌條件下分離Sprague Dawley（SD）大鼠尾椎椎間盤髓核組織,進行髓核細胞（Nucleus pulposus cells,NPCs）原代培養(yǎng)。應(yīng)用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS,1 μg/mL）誘導(dǎo)NPCs氧化應(yīng)激后,分別向培養(yǎng)基中加入Aspirin（5μg/mL或25μg/mL）。依次檢測活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和炎癥因子的表達、并通過實時熒光定量PCR、細胞免疫熒光染色技術(shù)來觀察髓核細胞的退變程度。體內(nèi)實驗中,利用大鼠尾椎椎間盤穿刺模型誘... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１：?ＮＰＣｓ在倒置相差顯微鏡下形態(tài)??（Ａ）單個ＮＰＣｓ呈現(xiàn)梭形，（Ｂ）ＮＰＣｓ生長密度約８０％時的光鏡形態(tài)

第一部分?Ａｓｐｉｒｉｎ調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對椎間盤退變的影響及作用機制研究??胞增殖毒性實驗結(jié)果顯示：隨時間（１、３、５ｄ）的增加，細胞增殖逐漸加快；與對照??組相比，ＬＰＳ濃度低于１０?ｐｇ／ｍＬ時不會對ＮＰＣｓ增殖產(chǎn)生不利影響；在１０?ｎｇ／ｍＬ或??１００?ｐｇ／ｍＬ濃度下ＮＰＣｓ，盡管增殖仍呈現(xiàn)隨時間延長而増殖的趨勢，但與對照組相??比，增殖能力明顯受到抑制（圖１．２）。??—?—??圖１．１：?ＮＰＣｓ在倒置相差顯微鏡下形態(tài)??（Ａ）單個ＮＰＣｓ呈現(xiàn)梭形，（Ｂ）ＮＰＣｓ生長密度約８０％時的光鏡形態(tài)。（比例尺：??４００?（ｉｍ）?〇??２?．５?１???—？?１?ＤＡＹ?３?ＤＡＹ?Ｋ３?５?ＤＡＹ??ｉｌｉｉｉｌｉｌｉｉｉｉｉｉ??ＬＰＳ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｐｇ／ｍＬ）??圖１．２：?ＣＣＫ８檢測ＬＰＳ對ＮＰＣｓ的增殖毒性??ＮＰＣｓ?與不同濃度?ＬＰＳ?（０、０．０１、０．１、１、１０、１００?｜＿ｉｇ／ｍＬ）共培養(yǎng)不同天數(shù)（１、??３、５ｄ）。當ＬＰＳ濃度低于１０ｐｇ／ｍＬ對細胞增殖無影響。（＊Ｐ＜０．０５）。??２．?ＬＰＳ誘導(dǎo)ＮＰＣｓ氧化應(yīng)激??經(jīng)過上述實驗，我們明確了使用ＬＰＳ的合理濃度范圍。實驗中我們分別選擇不??同濃度ＬＰＳ?（０、０．０１、０．１、１昭／ｍＬ）處理ＮＰＣｓ，共兩塊２４孔板。在ＬＰＳ處理２４??ｈ后，應(yīng)用熒光探針標記ＲＯＳ，第一塊２４孔板上的ＮＰＣｓ在倒置熒光顯微鏡下觀察??１２??

Ａｓｐｉｒｉｎ調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激對椎間盤退變的影響及作用機制研究?第一部分??可見：當ＬＰＳ濃度增加時，所標記的熒光強度及標記的細胞數(shù)量均呈現(xiàn)遞增趨勢（圖??１．３?Ａ）。第二塊２４孔板上的ＮＰＣｓ通過流式儀進行熒光強度量化分析，我們發(fā)現(xiàn)熒光??強度隨ＬＰＳ濃度增加而增加（圖１．３Ｂ）。隨后我們應(yīng)用ｌ＾ｇ／ｍＬ的ＬＰＳ選擇不同的時??間（０、０．２５、０．５、１、３、６、１２、２４?ｈ）來處理ＮＰＣｓ，并再次通過流式細胞儀觀察熒??光值來評估和量化氧化應(yīng)激強度。結(jié)果顯示：ＬＰＳ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激呈現(xiàn)出明顯的時間??依賴性，并在１２ｈ時達到最大值（圖１．３Ｃ）。??接著我們通過Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ實驗觀察蛋白水平的表達情況，結(jié)果顯示．？相比對照??組，ＬＰＳ能夠有效誘導(dǎo)ＮＰＣｓ產(chǎn)生ｉＮＯＳ和ＣＯＸ２兩種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白，并減少保??護性蛋白?Ｎｕｃｌｅａｒ?ｆａｃｔｏｒ－ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ?２－ｒｅｌａｔｅｄ?ｆａｃｔｏｒ?２?（Ｎｒｆ－２）的表達（圖?１．４?Ａ－Ｄ）。??Ｂ?Ｃ??Ｓ?Ｓ００！?ｆ?１０００－??？—?４５０－?Ｓ?．??ｇ?＊?？?８００－?ｊ??－ｉ?＿?卜??■?ＩＩ?Ｈａ??ｎｕ?ｍ?ｍ－ｍ?ｉ?：Ｕ＾ｉＵ??ｆ?＾?Ｋ?｜?０?、辦?Ａ?爺??ＬＰＳ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｐｇ／ｍＬ）?ＬＰＳ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｔｉｍｅ?（ｈｏｕｒ）??圖１．３：?ＬＰＳ誘導(dǎo)ＮＰＣｓ氧化應(yīng)激??（Ａ）倒置熒光顯微鏡下觀察不同濃度ＬＰＳ誘導(dǎo)ＮＰＣｓ氧化應(yīng)激。（Ｂ）流式細胞??１３??


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