研究背景隨著人口數(shù)量增長,人口老齡化程度加劇及致癌因素的普遍性,癌癥發(fā)病率和病死率呈上升趨勢。目前,我國癌癥的發(fā)病率略次于美國位列全球第二,癌癥病死率位于各國之首,發(fā)病率和病死率遠遠高于世界平均水平。癌痛是中晚期癌癥患者不可避免的問題。骨癌痛(BCP)是最常見的癌痛類型,常由原發(fā)性骨腫瘤或腫瘤繼發(fā)骨轉(zhuǎn)移引起。原發(fā)骨腫瘤及約三分之一腫瘤骨轉(zhuǎn)移的患者都會出現(xiàn)不同程度的骨痛,約三分之二的晚期癌癥都傾向于骨轉(zhuǎn)移,常轉(zhuǎn)移至后腰部、骨盆、長骨及肋骨。盡管骨骼不是重要器官,很多常見的腫瘤都容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。腫瘤的骨轉(zhuǎn)移被認為是BCP形成的最常見原因,腫瘤轉(zhuǎn)移至骨骼及侵犯周圍組織,可導致疼痛,后者及伴隨的高鈣血癥、易感染、病理性骨折及脊柱穩(wěn)定性差,不僅影響患者的生活質(zhì)量,亦可導致患者的抑郁和焦慮,給家庭和社會造成沉重負擔。現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物或療法,包括阿片類藥物,非甾體類抗炎藥物、雙膦酸鹽類藥物及放療,常無法達到足夠的鎮(zhèn)痛效果或伴有嚴重不良反應。因此,明確BCP形成和維持機制及發(fā)現(xiàn)有效的治療方法對于改善患者的生活質(zhì)量,減輕家庭和社會負擔具有一定意義。內(nèi)皮素-1(ET-1)是由二十一個氨基酸組成的多肽鏈,是人體內(nèi)含量最多的三種內(nèi)皮素之一。作為神經(jīng)調(diào)質(zhì),其廣泛表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng),參與多種疼痛調(diào)節(jié)。其調(diào)節(jié)疼痛主要是通過活化內(nèi)皮素A受體(ETAR)和內(nèi)皮素B受體(ETBR)實現(xiàn)的,兩者皆為其特異性G蛋白偶聯(lián)受體。ET-1在疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,鞘內(nèi)注射ET-1可減輕疼痛模型動物的疼痛。相同地,在炎性痛和神經(jīng)病理性痛模型中,星形膠質(zhì)細胞過表達ET-1小鼠表現(xiàn)出疼痛減輕,而神經(jīng)元特異性ET-1敲除小鼠則顯示出了相反的結(jié)果。在神經(jīng)病理性痛中,ET-1、ETAR和ETBR表達上調(diào),共同參與疼痛的調(diào)節(jié)。BCP具有神經(jīng)病理性痛特征,而ET-1、ETAR和ETBR在BCP中的表達變化,尚不清楚。蛋白激酶B(Akt)是介導多種細胞增殖、存活和分化的信號傳導通路,廣泛表達于脊髓背角Ⅰ-Ⅳ層,調(diào)節(jié)傷害性刺激。其參與炎性痛和神經(jīng)病理性痛引發(fā)的中樞敏化。除Akt外,細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路在突觸和神經(jīng)元可塑性的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用,它同樣調(diào)節(jié)傷害性刺激誘發(fā)的外周和中樞敏化。脊髓Akt和ERK通路存在交叉和聯(lián)系,共同參與神經(jīng)病理性痛時機體的病理生理學和神經(jīng)化學變化。在神經(jīng)病理性痛中脊髓Akt和ERK表達上調(diào),共同促進疼痛的發(fā)展。BCP具有神經(jīng)病理性痛特征,而脊髓Akt和ERK通路在BCP中的作用,尚不清楚。盡管ET-1調(diào)節(jié)疼痛通過活化ETAR和ETBR實現(xiàn),但主要是通過ETAR介導的。如當ET-1施加于暴露的坐骨神經(jīng)外時,大鼠產(chǎn)生患側(cè)后爪退縮,這種作用可被提前腹腔注射嗎啡阻斷或完全預防,注射ETAR拮抗劑可逆轉(zhuǎn),但ETBR拮抗劑無效。在熱痛模型中,中樞給予ET-1的鎮(zhèn)痛作用可被ETAR拮抗劑阻斷,而ETBR拮抗劑無效,表明ET-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛作用通過ETAR,而非ETBR介導。在脊髓損傷模型中,鞘內(nèi)注射ETAR拮抗劑BQ-123可減輕神經(jīng)病理性痛,而ETBR拮抗劑BQ-788無效,此結(jié)果表明,ET-1調(diào)節(jié)疼痛通過ETAR,并不通過ETBR。脊髓Akt和ERK表達上調(diào)參與神經(jīng)病理性痛的而形成和維持,而抑制Akt和ERK或其上游蛋白的表達可減輕疼痛。鞘內(nèi)注射ETAR受體拮抗劑BQ-123可下調(diào)神經(jīng)病理性痛小鼠脊髓Akt和ERK表達而減輕疼痛。由于BCP具有神經(jīng)病理性痛特征,鞘內(nèi)注射ETAR拮抗劑對小鼠BCP的影響及機制,尚不清楚。本研究一方面旨在明確脊髓ET-1及其受體在BCP中變化,同時評價脊髓Akt和ERK通路在BCP成形和維持中的作用,為明確BCP機制,發(fā)現(xiàn)可能的治療靶點提供依據(jù);另一方面,通過評價鞘內(nèi)注射ETAR拮抗劑對小鼠BCP的影響,明確了其減輕BCP的可能分子機制,可為臨床BCP治療方法的研究提供新方向。本研究分為兩部分,第一部分:脊髓ET-1及其受體、Akt和ERK通路在BCP中的變化;第二部分:鞘內(nèi)注射ETAR拮抗劑通過抑制脊髓Akt和ERK通路減輕對小鼠BCP。研究目的第一部分:小鼠BCP模型制備成功后,通過檢測痛行為學、組織學、脊髓ET-1、ETAR和ETBR基因表達及蛋白表達,Akt和ERK通路蛋白表達,明確ET-1及其受體在BCP中的變化及脊髓Akt和ERK通路在BCP形成和維持中的作用。第二部分:鞘內(nèi)注射ETAR拮抗劑BQ-123后,通過檢測小鼠痛行為學及脊髓Akt和ERK通路蛋白表達,明確鞘內(nèi)注射BQ-123對小鼠BCP的影響及可能機制。研究方法第一部分:NCTC 2472腫瘤細胞系培養(yǎng)于含10%馬血清NCTC 135培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為37℃,5%CO2和95%02,細胞每周傳代兩次。雄性C3H/HeJ小鼠,4～6周齡,體質(zhì)量20～25 g,采用股骨骨髓腔接種NCTC 2472腫瘤細胞的方法制備BCP模型。將小鼠隨機分為兩組:假手術(shù)組(Sham組)和骨癌痛組(BCP組)。每組隨機選擇8只小鼠固定行痛行為學檢測,包括自發(fā)抬足次數(shù)(NSF)和機械縮足反應閾(PWT)。采用盲法,痛行為學檢測人員對小鼠的處理方式不知情。于腫瘤細胞接種后-1、7、14和21 d分別檢測NSF和PWT,隨后每組隨機處死5只小鼠,取脊髓L4-6節(jié)段,采用實時定量PCR法檢測ET-1mRNA、ETAR mRNA 和 ETBR mRNA 表達水平。采用 Western blot 法檢測 ET-1、ETAR和ETBR蛋白表達,同時檢測磷酸化Akt(p-Akt)、總Akt(t-Akt)、磷酸化ERK-1/2(p-ERK-1/2)和總 ERK-1/2(t-ERK-1/2)表達,并計算 p-Akt/t-Akt 和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。于腫瘤細胞接種后21d,各組分別取患側(cè)股骨行組織學檢測。第二部分:將小鼠隨機分為7組:Sham+NS組、Sham+BQ-123組、Sham+BQ-788組、BCP組、BCP+NS、BCP+BQ-123和BCP+BQ-788組。每組隨機選擇8只小鼠固定行NSF檢測,另選擇8只小鼠固定行PWT檢測。選擇L5-6椎間孔穿刺行鞘內(nèi)注射給藥。于腫瘤細胞接種后14d(痛行為學檢測后)行鞘內(nèi)注射,Sham+BQ-123組和 BCP+BQ-123組小鼠分別鞘內(nèi)注射BQ-123(30 nmol in7 μl per dose),Sham+BQ-788組和BCP+BQ-788組小鼠分別鞘內(nèi)注射BQ-788(10 nmol in 7μlper dose),Sham+NS組和BCP+NS組注入等量生理鹽水,注射速度為1 μl/s。痛行為學檢測于鞘內(nèi)注射前即刻及注射后每30 min檢測一次,至注射后180 min。采用盲法,痛行為學檢測人員對小鼠的處理方式不知情。痛行為學檢測中,于BCP+BQ-123組痛行為學改善最明顯的時點,每組隨機選擇5只小鼠,處死后取脊髓L4-6節(jié)段,采用Western boot法檢測p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2及t-ERK-1/2的表達水平,并計算p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。結(jié)果第一部分:與-1d時比較,Sham組于腫瘤細胞接種后4、7、10、14和21 d時NSF和PWT變化差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),BCP組于腫瘤細胞接種后7、10、14 和 21d 時 NSF 升高,PWT 降低(P0.01 或 0.001);與 Sham 組比較,BCP 組小鼠 7、10、14 和 21 d 時 NSF 升高,PWT 降低(P0.01 或 0.001)。組織學結(jié)果表明,BCP組小鼠出現(xiàn)腫瘤生長和骨質(zhì)破壞,腫瘤細胞嚴重浸潤和侵蝕骨皮質(zhì),而Sham組小鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)基本正常。與-1 d 時比較,Sham 組小鼠 7 d、14 d 和 21 d 時 ET-1 mRNA、ETARmRNA和ETBRmRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),BCP組小鼠14d和21 d 時 ET-1 mRNA、ETAR mRNA 和 ETBR mRNA 及蛋白表達上調(diào)(P0.05、0.01或0.001),7d時差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與Sham組比較,BCP組小鼠 7、14、21d 時 ET-1mRNA、ETARmRNA 和 ETBRmRNA 及蛋白表達上調(diào)(P0.05,0.01或0.001)。在觀察時點內(nèi),Sham組小鼠p-Akt、p-ERK-1/2表達及p-Akt/t-Akt和p-ERK-1/2/t-ERK-1/2并未見明顯變化,而BCP組小鼠上述指標呈現(xiàn)時間依賴式的表達上調(diào)。與Sham組比較,BCP組小鼠7 d、14 d和21 d時p-Akt和p-ERK-1/2表達上調(diào),p-Akt/t-Akt和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2 增加(P0.05、0.01 或 0.001)。第二部分:與 Sham+NS 組、Sham+BQ-123 組、Sham+BQ-788 組比較,BCP組、BCP+NS和BCP+BQ-788組小鼠表現(xiàn)為NSF升高和PWT降低(P0.001),且痛行為學指標在鞘內(nèi)注射后180min的觀察時間內(nèi)基本保持不變。而鞘內(nèi)注射后,BCP+BQ-123組痛行為學出現(xiàn)了“V”字型變化,表現(xiàn)為NSF在鞘內(nèi)注射后0～90 min內(nèi)急劇下降,90 min時達到最低點,90 min后開始急劇上升,180min時基本回復至鞘內(nèi)注射前水平。PWT的變化趨勢與NSF完全相反。因此,于鞘內(nèi)注射后90 min時,每組隨機選擇5只小鼠,處死后取脊髓L4-6節(jié)段,采用Westem blot 法檢測磷酸化 p-Akt、t-Akt、p-ERK-1/2 和 t-ERK-1/2 水平,并計算 p-Akt/t-Akt和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2。結(jié)果顯示,與 BCP 組和 BCP+NS 組比較,BCP+BQ-123組小鼠脊髓 p-Akt、p-ERK-1/2 表達下調(diào),p-Akt/t-Akt 和 p-ERK-1/2/t-ERK-1/2 降低(P0.001)。結(jié)論第一部分:脊髓ET-1及其受體參與BCP的維持,脊髓Akt和ERK通路在BCP的形成和維持中發(fā)揮重要作用。第二部分:鞘內(nèi)注射ETAR拮抗劑可能通過抑制脊髓Akt和ERK通路減輕小鼠BCP。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R614
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
研究一 脊髓內(nèi)皮素-1及其受體、Akt和ERK通路在骨癌痛中的變化
    1. 研究背景
    2. 材料與方法
    3. 結(jié)果
    4. 討論
    5. 結(jié)論
研究二 鞘內(nèi)注射內(nèi)皮素A受體拮抗劑通過抑制脊髓Akt和ERK通路減輕對小鼠骨癌痛
    1. 研究背景
    2. 材料與方法
    3. 結(jié)果
    4. 討論
    5. 結(jié)論
附圖表
細胞培養(yǎng)及實驗室檢測流程
參考文獻
致謝
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英文論文一
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本文編號：2889285