皮膚是保護人體免受外界刺激、外界損傷的第一道屏障,臨床上由各種急、慢性致傷因素導致的皮膚損傷十分常見。皮膚創(chuàng)面的愈合是一個復雜的動態(tài)過程,主要涉及炎癥、增殖和重塑三個重疊階段,嚴重創(chuàng)傷愈合后往往導致局部組織膠原過度沉積和纖維化,形成增生性瘢痕,嚴重影響患者的心理健康和生理功能,因此各種創(chuàng)傷所致的創(chuàng)面修復仍是一個嚴峻的醫(yī)學和社會問題。近年來,一類在轉錄后水平調控蛋白表達參與多種生物學功能的小非編碼RNA—microRNA被發(fā)現(xiàn),它們在創(chuàng)面愈合中的調控作用也被逐漸發(fā)現(xiàn)和重視。大量研究發(fā)現(xiàn),皮膚創(chuàng)面愈合過程中多種miRNAs差異表達,某些miRNAs參與了創(chuàng)面愈合中炎癥、增殖、重塑三個復雜動態(tài)修復過程。據研究報道,miR-203和miR-210可通過介導角質形成細胞增殖和遷移進而誘導創(chuàng)面愈合,而miR-99和miR-200家族則可通過抑制角質形成細胞遷移來抑制創(chuàng)面愈合。其他研究還發(fā)現(xiàn),與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的癌癥相關miRNA—miR-21在皮膚創(chuàng)傷組織中表達水平顯著上調,抑制miR-21表達可顯著抑制創(chuàng)面愈合和膠原沉積,而過表達miR-21則促進了創(chuàng)面愈合。同時,大量研究已證實miR-21在肺、腎和肝臟等多種組織臟器中具有促進組織纖維化作用,且在增生性皮膚瘢痕中也呈高表達狀態(tài),表明miR-21可能是一種創(chuàng)傷后促進創(chuàng)面愈合的應激保護分子。此外,已有研究證實,miR-21也能夠調節(jié)外周血中樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)的分化和功能,而樹突狀細胞在傷口修復中也起著非常重要的作用,增加DCs的數量可顯著促進創(chuàng)面的愈合,而減少DCs的數量則表現(xiàn)為創(chuàng)面愈合延遲。因此,我們推測:創(chuàng)面組織中過表達miR-21會不會通過增加創(chuàng)傷組織中DCs含量進而促進創(chuàng)面愈合?本研究擬采用過表達miR-21模擬物或抑制劑的慢病毒感染SD大鼠皮膚創(chuàng)面組織來調控創(chuàng)面局部miR-21表達水平,在體內觀察miR-21對創(chuàng)面組織中DCs細胞含量、創(chuàng)面愈合及相關指標和信號通路PTEN/PI3K/AKT的影響,并通過體外細胞模型進一步研究進行驗證miR-21對DCs分化和角質形成細胞遷移的影響,以探討miR-21在創(chuàng)面愈合中的作用及潛在分子作用機制。第一部分大鼠創(chuàng)面組織中miR-21及相關指標的表達研究方法取25只清潔級雄性SD大鼠室內適應飼養(yǎng)7d,經腹腔注射1%戊巴比妥鈉(350 mg/kg)對其進行麻醉,然后固定于手術臺上,對背部7 cm×3 cm大小區(qū)域進行脫毛處理,碘伏酒精消毒后,用無菌手術刀制作4 cm~2的全層皮膚缺損創(chuàng)面,全層切開皮膚,開放創(chuàng)面,深達肌肉,充分止血,創(chuàng)面以無菌紗布覆蓋,外用醫(yī)用膠布固定,自由進食飲水。于造模后即刻、第6h、24h、48h、72h隨機抽取5只SD大鼠,取各大鼠創(chuàng)面滲出液,檢測其細胞含量,并取創(chuàng)面組織進行分子生物學相關檢測。結果創(chuàng)面損傷模型建立后,分別于0h、6h、24h、48h、72h時檢測創(chuàng)傷組織中miR-21表達,發(fā)現(xiàn)miR-21表達均顯著上調,且于24h時表達達到最大值;基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9,MMP-9)的表達與miR-21趨勢相同,在創(chuàng)傷形成后6h內顯著增加,并于24h達到最大值。傷口形成后72h內,傷口滲出液中細胞總數也明顯增加,同時CD11c+CD209+DCs的含量也隨之顯著增加。進一步分析表明,miR-21的表達與MMP-9的表達呈顯著正相關(r=0.9027),同樣也與CD11c+CD209+DCs的含量呈顯著正相關(r=0.9348)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),傷口形成后72h內,第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)蛋白表達顯著降低,磷酸化蛋白激酶B(phosphate protein kinase B,p-Akt)p-AKT蛋白表達顯著增加,而總的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)無明顯變化。結論創(chuàng)傷形成后,創(chuàng)面組織中miR-21、MMP-9、p-AKT表達以及創(chuàng)面滲出液中細胞總數和CD11c+CD209+DCs含量均顯著增加,并于24h時均達到最大值,而創(chuàng)傷組織中PTEN表達顯著降低,并于24h時達到最小值。MiR-21的表達與MMP-9的表達和CD11c+CD209+DCs的含量呈顯著正相關。第二部分MiR-21對皮膚創(chuàng)面愈合的影響研究方法將過表達和抑制miR-21表達的慢病毒載體(LV-miR-21 mimic和LV-miR-21 inhibitor)與包裝質粒轉染至293T細胞中包裝慢病毒。取160只清潔級雄性SD大鼠,按照第一部分方法制備創(chuàng)面損傷SD大鼠模型,并隨機分為4組:control組、LV-NC組、LV-miR-21 mimic組和LV-miR-21 inhibitor組,每組40只,其中control組創(chuàng)面局部注射5μl生理鹽水,其他各組分別注射對應的慢病毒5μl。造模后分別于第1、3、5、7、9、11、13、15天,利用透明薄膜覆蓋大鼠創(chuàng)面,數碼相機拍照后用圖像分析軟件Image-proplus6.0對創(chuàng)面面積進行統(tǒng)計分析處理,計算公式為:創(chuàng)面殘留率=殘余創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積×100%;qRT-PCR檢測創(chuàng)面組織中miR-21和PTEN mRNA變化;流式細胞儀檢測創(chuàng)口滲出液中CD11c+CD209+DCs的含量;Western blot檢測創(chuàng)面組織中PTEN、p-AKT、AKT以及MMP-9蛋白表達水平。結果與control組和LV-NC組相比,LV-miR-21 mimic組創(chuàng)傷組織中miR-21的表達明顯上調,而LV-miR-21 inhibitor組中miR-21表達則顯著被抑制。與control組相比,LV-miR-21 mimic能夠明顯改善大鼠皮膚創(chuàng)面愈合,而LV-miR-21inhibitor則顯著延緩創(chuàng)面愈合進程。CD11c+CD209+DCs的含量隨miR-21表達的增加而增加,隨miR-21表達的降低而降低。創(chuàng)傷形成后3天,LV-miR-21 mimic可在mRNA和蛋白水平上抑制PTEN的表達,相反LV-miR-21 inhibitor則可促進PTEN mRNA和蛋白的表達。過表達miR-21也可在蛋白水平上顯著上調p-AKT和MMP-9的表達;相比之下,抑制miR-21則可使p-AKT和MMP-9的蛋白表達明顯降低。結論過表達miR-21能夠明顯縮短大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合時間,誘導創(chuàng)面組織中CD11c+CD209+DCs的含量及p-AKT和MMP-9的表達增加,抑制創(chuàng)面組織中PTEN表達;相反,抑制miR-21則可顯著延緩創(chuàng)面愈合進程,降低創(chuàng)面組織中CD11c+CD209+DCs的含量及p-AKT和MMP-9的表達,促進創(chuàng)面組織中PTEN表達。上述結果表明,增加miR-21的表達可促進皮膚創(chuàng)面的愈合,反之則會延緩創(chuàng)面的愈合。第三部分MiR-21通過改變DCs含量影響創(chuàng)面的愈合研究方法取60只清潔級雄性SD大鼠,按照第一部分方法制備創(chuàng)面損傷SD大鼠模型,并隨機分為4組:control組、FL(fms-like tyrosine kinase-3 ligand,FMS樣酪氨酸激酶-3配體)組、LV-miR-21 inhibitor組和LV-miR-21 inhibitor+FL組,每組15只,其中control組創(chuàng)面局部注射5μl生理鹽水,LV-miR-21 inhibitor組和LV-miR-21 inhibitor+FL組創(chuàng)面局部注射LV-miR-21 inhibitor慢病毒5μl,FL組和LV-miR-21 inhibitor+FL組于創(chuàng)傷部位周圍真皮組織注射FMS樣酪氨酸激酶-3配體(FL)來刺激DCs分化,每日注射10μg,連續(xù)注射4天。造模后分別于第1、3、5天,利用透明薄膜覆蓋大鼠創(chuàng)面,數碼相機拍照后用圖像分析軟件Image-proplus6.0對創(chuàng)面面積進行統(tǒng)計分析處理,計算公式為:創(chuàng)面殘留率=殘余創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積×100%;qRT-PCR檢測創(chuàng)面組織中miR-21和PTEN mRNA變化;流式細胞儀檢測創(chuàng)口滲出液中CD11c+CD209+DCs的含量;Western blot檢測創(chuàng)面組織中PTEN、p-AKT、AKT以及MMP-9蛋白表達水平。結果創(chuàng)面形成后1、3、5天分別檢測創(chuàng)面殘留率,發(fā)現(xiàn)LV-miR-21 inhibitor組創(chuàng)面愈合明顯減緩,而應用FL組則顯著促進皮膚創(chuàng)面的愈合,并逆轉LV-miR-21inhibitor對傷口愈合的抑制作用。應用FL可誘導創(chuàng)面組織中CD11c+CD209+DCs含量增加,并促進miR-21、p-AKT和MMP-9的表達以及抑制PTEN的表達。此外,LV-miR-21 inhibitor對CD11c+CD209+DCs含量及miR-21、p-AKT、MMP-9、PTEN表達的影響可被FL部分逆轉。結論MiR-21 inhibitor顯著延緩了創(chuàng)面愈合,降低了創(chuàng)面滲出液中DCs含量,抑制了p-AKT、MMP-9表達及促進PTEN表達,而FL則逆轉了miR-21 inhibitor的作用,表明miR-21可能通過增加創(chuàng)面組織中DCs的含量促進創(chuàng)面愈合。第四部分MiR-21對DCs分化的影響研究方法用淋巴細胞分離液分離大鼠外周血單個核細胞(PBMCs),將分離得到的PBMCs在含有10%FBS和1%鏈霉素青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37°C、5%CO_2的加濕保溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將miR-21模擬物/抑制劑或miR-NC轉染至PBMCs中,后用重組大鼠GM-CSF和IL-4誘導培養(yǎng)5天。流式細胞儀檢測誘導后PBMCs中CD11c+CD209+DCs的含量;qRT-PCR檢測PBMCs中miR-21、PTEN和MMP9的表達變化;ELISA法檢測PBMCs上清液中MMP-9的分泌;Western blot檢測PTEN、p-AKT、AKT和MMP-9蛋白表達。結果過表達miR-21顯著促進了PBMCs中DCs的分化,而miR-21 inhibitor抑制了DCs的分化。另外miR-21 inhibitor顯著上調PTEN mRNA和蛋白表達,而過表達miR-21則明顯抑制了PTEN的表達。MiR-21 inhibitor可抑制MMP-9的分泌和p-AKT表達,miR-21模擬物的作用則與之相反。結論過表達miR-21能夠促進PBMCs中DCs的分化,抑制PTEN表達并促進p-AKT和MPP-9的表達,誘導細胞上清培養(yǎng)液中MMP-9分泌增加。第五部分PTEN通過PI3K/AKT信號通路對DCs分化的影響研究方法用淋巴細胞分離液分離大鼠外周血單個核細胞(PBMCs),將分離得到的PBMCs在含有10%FBS和1%鏈霉素青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37°C、5%CO_2的加濕保溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將PTEN干擾RNA—si-PTEN轉染至PBMCs中,聯(lián)合或不聯(lián)合PI3K/AKT抑制劑LY 294002處理,后用重組大鼠GM-CSF和IL-4誘導培養(yǎng)5天。流式細胞儀檢測誘導后PBMCs中CD11c+CD209+DCs的含量;ELISA實驗檢測PBMCs上清液中MMP-9的分泌量;Western blot檢測p-AKT和AKT的蛋白表達。結果PTEN基因敲除能有效地促進PBMCs中DCs的分化和MMP-9的分泌及p-AKT的蛋白表達,而PI3K/AKT抑制劑LY 294002則能明顯減輕si-PTEN誘導的DCs含量、MMP-9分泌和p-AKT的蛋白表達。結論PTEN能夠通過PI3K/AKT信號通路抑制PBMCs中DCs的分化和細胞上清培養(yǎng)液中MMP-9的分泌。第六部分MiR-21通過調節(jié)PTEN促進DCs分化進而影響角質形成細胞的遷移研究方法利用TargetScan在線生物信息學分析網站和雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-21與PTEN之間的靶向調控關系。用淋巴細胞分離液分離大鼠外周血單個核細胞(PBMCs),將分離得到的PBMCs在含有10%FBS和1%鏈霉素青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37°C、5%CO_2的加濕保溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將miR-21 inhibitor和/或si-PTEN轉染至PBMCs中,用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)5d。ELISA實驗檢測PBMCs上清液中MMP-9的分泌量;用轉染PBMCs的上清液培養(yǎng)角質形成細胞,劃痕實驗檢測角質形成細胞的遷移變化。結果TargetScan在線生物信息學分析顯示miR-21和PTEN中存在互補結合的核苷酸序列。雙熒光素酶報告基因實驗表明,轉染miR-21 mimic可顯著抑制PTEN的熒光素酶活性。用轉染miR-21 inhibitor的細胞上清液培養(yǎng)角質形成細胞后細胞的遷移能力顯著降低,而沉默PTEN則逆轉了miR-21 inhibitor對角質形成細胞遷移的抑制作用。進一步研究證實,轉染miR-21 inhibitor能夠降低PBMCs上清液中MMP-9的含量,而這種下調作用可被沉默PTEN所逆轉。結論MiR-21能夠通過靶向調節(jié)PTEN的表達促進DCs的分化進而影響角質細胞的遷移。綜上所述,miR-21對創(chuàng)面愈合的促進作用可能是通過抑制PTEN激活PI3K/AKT信號通路增加DCs的含量而實現(xiàn)的。MIR-21對創(chuàng)面愈合有著深遠的影響,本研究為旨在通過調節(jié)miR-21增加DCs含量而促進創(chuàng)面愈合的新治療策略應用提供了實驗依據。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R641
【部分圖文】：

法 SPSS 22.0 軟件進行分析，所有數據以均數±標準差符合正態(tài)分布，兩組數據比較用獨立樣本 t 檢驗，差分析，以 P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。結 果組織中 miR-21 的表達 可以看出，創(chuàng)傷模型建立后 0h、6h、24h、48h、72中 miR-21 表達，發(fā)現(xiàn)與 0h 相比，其他各個時間點于 24h 時達到最大值，差異顯著（P<0.01）。

間點創(chuàng)面組織滲出液中總細胞數的變化；注：與 0h 組umber in wound fluids at different time points; **P< 0. 01group織滲出液中 CD11c+CD209+ DCs 含量變化1.3 所示，創(chuàng)傷模型建立后 0h、6h、24h、48h、滲出液中 CD11c+ CD209+ DCs 含量變化，發(fā)現(xiàn)組織滲出液中 CD11c+ CD209+ DCs 數量均顯著進一步分析發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面組織中 miR-21 表達與創(chuàng)9+ DCs 的數量呈正相關（r=0.9348），差異具

點創(chuàng)面組織滲出液中 CD11c+ CD209+ DCs 含量變化；注**P<0.01entage of CD11c+ CD209+ DCs in wound fluids at differen0. 01, compared with 0h group組織中 MMP-9 mRNA 表達變化 1.4 所示，創(chuàng)傷模型建立后 0h、6h、24h、48h、中 MMP-9 mRNA 表達變化，發(fā)現(xiàn)與 0h 相比，其P-9 mRNA 表達均顯著增加，且于 24h 時達到最織中 miR-21 表達與 MMP-9 的表達呈正相關(r=（P<0.05）。
【參考文獻】

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本文編號：2875368