研究背景:股骨頭壞死(Osteonecrosis of Femoral Head,ONFH)是以股骨頭血供受損,骨細(xì)胞及骨髓成份死亡,繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變、股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙為特征的骨科常見(jiàn)疾病,高發(fā)于青壯年。因股骨頭壞死塌陷而行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者占全部全髖關(guān)節(jié)置換總數(shù)的30%,為家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在中國(guó),激素的應(yīng)用仍為股骨頭壞死發(fā)生的首要危險(xiǎn)因素,激素性股骨頭壞死約占股骨頭壞死總數(shù)的35%。目前,激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制仍不明確,因而限制了對(duì)于激素性股骨頭壞死早期診斷方法和干預(yù)手段的發(fā)展。研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的數(shù)量減少及細(xì)胞行為的改變與激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而,對(duì)于激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性改變存在爭(zhēng)議。在前期研究中,課題組在激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的miRNA。然而,miRNA的差異表達(dá)不能完全闡釋激素性股骨頭壞死的發(fā)生機(jī)制,多種非編碼RNA可以在轉(zhuǎn)錄組層面進(jìn)行相互作用從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。因此,全面的理解激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)可能為進(jìn)一步的探索其發(fā)生機(jī)制提供條件。研究目的:1.比較激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與正常對(duì)照之間的細(xì)胞功能差異。2.利用高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析技術(shù),在轉(zhuǎn)錄組層面研究激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞差異基因表達(dá)。3.在 BMSC 探索差異 lncRNA:lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和lncRNA-RP3-331H24.7 對(duì) BMSC 功能影響4.初步探索 lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7 與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 的相互作用機(jī)制。研究方法:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng):從7例激素性股骨頭壞死患者和7例正常對(duì)照體內(nèi)取骨髓組織,密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代,流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行驗(yàn)證。2.通過(guò)CCK-8和Edu增殖實(shí)驗(yàn)、AnnexinV-PI凋亡實(shí)驗(yàn)比較兩組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力和凋亡率的差異;誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨、成脂方向分化,通過(guò)堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色以及成骨、成脂標(biāo)記物的表達(dá)情況比較兩組之間的分化能力差異。3.通過(guò)高通量全基因組測(cè)序?qū)山M中各3例骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到激素性股骨頭壞死過(guò)程中差異表達(dá)的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA。4.通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集分析,并對(duì)lncRNA和mRNA、circRNA和miRNA進(jìn)行共表達(dá)分析,揭示其相互作用機(jī)制。5.在正常BMSC中過(guò)表達(dá)/低表達(dá)過(guò)表達(dá)lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7,觀察其在 BMSC 中與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p的相互作用以及對(duì)于BMSC功能的影響。研究結(jié)果:1.分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,表面抗原鑒定顯示CD29,CD44,CD73,CD90和CD105呈陽(yáng)性表達(dá),而CD31和CD45呈陰性表達(dá)。2.激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h和72h后,CCK-8吸光度值均顯著低于正常對(duì)照(24h:0.35±0.02vs0.39±0.04,P=0.02;48h:0.54±0.06 vs0.68±0.08,P=0.004;72h:0.92±0.04vs1.15±0.08,P=0.0006)。培養(yǎng) 24h 后其Edu陽(yáng)性率為26.67%± 10.85%,顯著低于正常對(duì)照的66.03%± 8.71%(p=0.0021),提示激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力降低。而其總凋亡率為24.64±3.68%,較正常對(duì)照組顯著增高(17.48±4.05%,p=0.0041)。3.通過(guò)堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、油紅O染色以及成骨(ALP,OCN,RUNX2和BSP)、成脂標(biāo)記物(PPARY,LPL和FABP4)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力減弱,成脂分化能力增強(qiáng)。4.在激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)3114個(gè)mRNA、572個(gè)lncRNA、224個(gè)miRNA和231個(gè)circRNA差異表達(dá)并構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。5.lncRNA-RP11-154D6 與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 的表達(dá)趨勢(shì)呈正相關(guān),且lncRNA-RP11-154D6 可以抑制 BMSC 增殖并促進(jìn)凋亡;lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7能夠促進(jìn)BMSC增殖并抑制凋亡過(guò)程,且其表達(dá)趨勢(shì)與 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論:1.激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡及分化能力均較正常細(xì)胞改變,可能是導(dǎo)致激素性股骨頭壞死發(fā)生的原因。2.激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中存在異常表達(dá)的mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA,這些異常表達(dá)的基因可能通過(guò)相互作用影響細(xì)胞功能,從而調(diào)控激素性股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展。3.lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7 可能通過(guò)與miR-30a-5p和miR-30c-5p的相互作用,調(diào)控BMSC增殖和凋亡過(guò)程。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R681.8
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果??１．骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定??骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀排列。既往文獻(xiàn)報(bào)道其表面標(biāo)記??ＣＤ２９，?ＣＤ４４，?ＣＤ７３，?ＣＤ９０?和?ＣＤ１０５?陽(yáng)性；ＣＤ３１?和?ＣＤ４５?陰性。??在本研究中，培養(yǎng)初期，可見(jiàn)少量梭形貼壁細(xì)胞，并伴有大量未貼壁圓形細(xì)胞。??延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間并不斷更換培養(yǎng)基后貼壁細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，局??部有突起，培養(yǎng)１４天后，細(xì)胞匯合度可達(dá)８０％，細(xì)胞呈旋渦狀排列（圖１Ｈ）。??收集第３代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面抗體表型，發(fā)現(xiàn)ＣＤ２９，??ＣＤ４４，ＣＤ７３，ＣＤ９０?和?ＣＤ１０５?呈陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率分別為?１００％，?９２．８％，９７．９％，??９５．４％和９９．９％，而ＣＤ３１和ＣＤ４５呈陰性表達(dá)，表達(dá)率分別為２．６％和０．８％?（圖??１Ａ－Ｇ）。??Ａ?Ｂ?Ｃ?Ｄ??

圖２Ｂ，??Ｐ＝０．０２）

?中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研宄生學(xué)位論文???圖２激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力下降??３．激素性股骨頭壞死患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡率明顯升髙??我們通過(guò)ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ染色法對(duì)兩組中全部１４例骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了凋亡??檢測(cè)。在激素性股骨頭壞死組全部７例骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，總凋亡率為??２４．６４±３．６８％，較正常對(duì)照組顯著增高（１７．４８±４．０５％，ｐ＝０．００４１）。其中，兩組細(xì)??胞之間的早期凋亡率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（６．４２±２．１３°／〇ｖｓ５．２９±２．１６°／。；ｐ＝０．４４５８），而??激素性股骨頭壞死組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的晚期凋亡細(xì)胞比例較正常顯著增高，兩??者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（１８．２１±３．０８％ｖｓｌ２．１９±２．００％；ｐ＝０．０００６）。圖３Ａ羅列了兩組??中各３例凋亡檢測(cè)的代表性結(jié)果（上列為激素性股骨頭壞死組，下列為正常對(duì)照??組），圖３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ分別顯示了兩組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡??率和總凋亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。??Ａ??
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2859444