發(fā)布時(shí)間：2020-10-27 14:25

　　 【目的】證明過氧化物酶體增殖物激活受體PPARδ激動(dòng)劑(GW0742)能夠促進(jìn)人關(guān)節(jié)液來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(human synovial fluid-derived mesenchymal stem cells,hSF-MSCs)成軟骨分化,并且能夠聯(lián)合hSF-MSCs更有效地抑制炎性環(huán)境中炎癥因子的表達(dá)�！痉椒ā坑�5ml注射器從膝骨關(guān)節(jié)炎患者患側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)抽取關(guān)節(jié)積液進(jìn)行分離培養(yǎng),并進(jìn)行鑒定。設(shè)置空白對照組、TGF-β1組、TGF-β1+GW0742組及GW0742組,采用Pellet法擬3D環(huán)境誘導(dǎo)hSF-MSCs成軟骨分化。通過比較各組細(xì)胞增殖速率、成軟骨分化相關(guān)標(biāo)志物SOX9基因表達(dá)和蛋白合成量以及阿利新藍(lán)、甲苯胺藍(lán)染色等指標(biāo)來評估GW0742對hSF-MSCs增殖及成軟骨分化能力的影響。另設(shè)置空白對照組、hSF-MSCs組、hSF-MSCs+GW0742組,通過比較第1、3天各組培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)來評估GW0742+hSF-MSCs組的抗炎效果�！窘Y(jié)果】通過直接貼壁法,成功從炎性關(guān)節(jié)液中分離培養(yǎng)hSF-MSCs,并鑒定屬于MSCs;就增殖能力而言,TGF-β1組、TGF-β1+GW0742組及GW0742組對hSF-MSCs無明顯影響;從PCR和Western Blot對SOX9檢測結(jié)果表明,GW0742組的hSF-MSCs成軟骨分化作用最為明顯;通過阿利新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果可以觀察到,GW0742組能夠分泌較多的蛋白聚糖,且比TGF-β1+GW0742組染色更為致密;在抗炎效果方面,hSF-MSCs+GW0742組炎癥因子的含量明顯低于單純hSF-MSCs組�！窘Y(jié)論】PPARδ激動(dòng)劑GW0742可能具備提升hSF-MSCs成軟骨分化的能力,并且聯(lián)合hSF-MSCs可能會(huì)增強(qiáng)在炎性環(huán)境中的抗炎效果。這為PPARδ激動(dòng)劑聯(lián)合間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨關(guān)節(jié)炎奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

結(jié) 果RESULTS1 細(xì)胞學(xué)觀察及鑒定1.1 hSF-MSCs 的細(xì)胞學(xué)觀察hSF-MSCs 接種 4h 后，可在顯微鏡下觀察到散在小圓點(diǎn)樣細(xì)胞貼壁，1d 后部分小圓點(diǎn)樣細(xì)胞變?yōu)殚L梭形細(xì)胞，其長軸徑較正常 MSCs 長，細(xì)胞透亮度難分辨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如圖 1A、1B）。隨著細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞長軸徑逐漸，細(xì)胞透亮度逐漸升高，并且出現(xiàn)集簇放射狀單克隆細(xì)胞團(tuán)落（如圖 1C）續(xù)傳代擴(kuò)增培養(yǎng)后，第 3 代 hSF-MSCs 細(xì)胞形態(tài)以呈長梭形狀貼壁布滿整個(gè)（如圖 1D）。

圖 2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原 CD105、CD73、CD29 呈陽性表達(dá)，CD45、CDHLA-DR 呈陰性表達(dá)3.1.3 成骨、成脂、成軟骨分化(1) 加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后，細(xì)胞質(zhì)中逐漸出現(xiàn)高密度不透光物質(zhì)，隨著間加長，礦化物質(zhì)逐漸增多，且面積增大，約 21 天后行茜素紅染色，可細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色或橙紅色物質(zhì)沉積，如圖 3A 所示。(2) 加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后，細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形變?yōu)闄E圓形，14 天后現(xiàn)細(xì)胞直徑縮小，形態(tài)逐漸變?yōu)閳A形或不規(guī)則形，排列較為雜亂，約 21行油紅 O 染色呈陽性，如圖 3B 所示。(3) 采用 Pellet 法加入成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基后，沉于離心管底部的細(xì)胞團(tuán)斷回縮，逐漸形成球狀細(xì)胞團(tuán)，換液時(shí)輕彈離心管底部可見細(xì)胞球能夠從部漂起并緩慢再次沉于底部。誘導(dǎo)后 14 天，換液時(shí)輕觸細(xì)胞球，可見細(xì)

26圖 3 hSF-MSCs 三系分化及其染色（A 為成骨分化茜素紅染色，B 為油紅 O 染色，C 為法成軟骨分化，D 為成軟骨分化軟骨球，E 為成軟骨分化 HE 染色，F(xiàn) 為成軟骨分化阿藍(lán)染色）3.1.4 hSF-MSCs 生長曲線繪制及增殖能力評估
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