研究背景:乳腺癌是世界3大癌癥之一,是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,高發(fā)病率地區(qū)可達(dá)每8-10位女性中就有1位罹患乳腺癌。癌細(xì)胞的無(wú)限增殖特性是乳腺癌一切惡性特征的生物學(xué)基礎(chǔ),而這一永生特性的維持需要多種分子生物學(xué)機(jī)制參與。ZEB1是一種E-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,參與多種癌基因表達(dá)的調(diào)控。以往對(duì)ZEB1的研究側(cè)重于它對(duì)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)以及對(duì)腫瘤遷移侵襲特性的調(diào)節(jié)。隨著研究的深入,越來(lái)越多的證據(jù)顯示ZEB1也參與腫瘤細(xì)胞增殖凋亡特性的調(diào)控。ZEB1在乳腺癌中參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)鮮見(jiàn)報(bào)道,且具體的調(diào)控機(jī)制亦尚未闡明。研究目的:探究ZEB1在乳腺癌細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)方式,驗(yàn)證ZEB1-hTERT這一通路是否在腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控中起到作用,以及探討二者之間相互作用的具體分子機(jī)制。研究方法:對(duì)133例乳腺癌組織及癌旁組織提取物進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)ZEB1和hTERT在m RNA水平的表達(dá),免疫組織化學(xué)檢測(cè)乳腺癌組織中ZEB1和hTERT在蛋白水平的表達(dá),驗(yàn)證二者之間的相關(guān)性。使用小干擾RNA技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF-7中人為降低ZEB1表達(dá),或使用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體上調(diào)ZEB1的表達(dá),qRT-PCR和western blot檢測(cè)hTERT在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)變化,驗(yàn)證ZEB1對(duì)hTERT的調(diào)控作用。升高或降低ZEB1表達(dá)后對(duì)端粒酶的活性和兩種乳腺癌細(xì)胞中染色體末端端粒長(zhǎng)度進(jìn)行檢測(cè),研究ZEB1調(diào)控hTERT表達(dá)所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。通過(guò)qRT-PCR和western blot檢測(cè)驗(yàn)證ZEB1的上調(diào)能否抵消hTERT下調(diào)所引起的表達(dá)水平的下降,恢復(fù)hTERT在m RNA和蛋白水平的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分別用于檢測(cè)同時(shí)下調(diào)hTERT和上調(diào)ZEB1后MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞增殖狀態(tài)和凋亡狀態(tài)與單獨(dú)敲除hTERT后細(xì)胞狀態(tài)的改變之間的差異。染色質(zhì)免疫共沉淀及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)用于分析ZEB1與hTERT啟動(dòng)子的結(jié)合情況。組織樣本及細(xì)胞樣本的DNA提取物進(jìn)行堿基測(cè)序,用于檢測(cè)hTERT啟動(dòng)子區(qū)域堿基突變情況。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)ZEB1和YAP的結(jié)合情況。染色質(zhì)免疫共沉淀及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)用于分析YAP與hTERT啟動(dòng)子的結(jié)合情況。構(gòu)建啟動(dòng)子截?cái)酂晒馑孛笀?bào)告基因質(zhì)粒,用于檢測(cè)ZEB1和YAP的相互作用和探究二者在調(diào)控hTERT轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的相互作用。qRT-PCR和western blot檢測(cè)YAP的表達(dá)變化對(duì)hTERT的m RNA和蛋白表達(dá)水平的調(diào)控。裸鼠皮下異種移植物造模用于分析ZEB1在機(jī)體內(nèi)對(duì)hTERT的調(diào)控作用。qRT-PCR和免疫組化用于檢測(cè)異種移植物中ZEB1和hTERT表達(dá)水平之間的聯(lián)系。研究結(jié)果:在乳腺癌組織中,ZEB1的表達(dá)和hTERT的表達(dá)在m RNA和蛋白水平呈明顯正相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7中ZEB1對(duì)hTERT的表達(dá)有正向調(diào)控作用。ZEB1的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)端粒酶活性升高,維持端粒長(zhǎng)度。ZEB1表達(dá)升高可以抵消si RNA引起的hTERT表達(dá)水平降低、細(xì)胞增殖減弱和細(xì)胞凋亡增多。分子作用機(jī)制研究結(jié)果顯示,ZEB1可以與YAP形成轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體,在乳腺癌細(xì)胞中結(jié)合于hTERT啟動(dòng)子-1051—-957bp處,發(fā)揮促啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性作用。在裸鼠異種移植物模型中,ZEB1對(duì)hTERT表達(dá)的調(diào)控作用依然存在。研究結(jié)論:本研究首次證實(shí)了ZEB1-hTERT通路在乳腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控中發(fā)揮作用。ZEB1可以募集共刺激因子YAP形成蛋白復(fù)合體,結(jié)合于hTERT啟動(dòng)區(qū)域促進(jìn)hTERT轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)hTERT的表達(dá),從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡。以往的研究已證實(shí)ZEB1可參與乳腺癌EMT的誘導(dǎo),調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲特性,本研究證實(shí)ZEB1也參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡,對(duì)ZEB1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用進(jìn)行了補(bǔ)充。這為ZEB1作為一個(gè)全面參與乳腺癌調(diào)控的分子,成為乳腺癌新的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R737.9
【文章目錄】：
前言
    參考文獻(xiàn)
中文摘要
Abstract
材料與方法
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    第一部分：hTERT的表達(dá)在乳腺癌中與 ZEB1 的表達(dá)水平呈正相關(guān)
        結(jié)果
            1.hTERT的表達(dá)在乳腺癌中與ZEB1的表達(dá)水平呈正相關(guān)
            2.ZEB1在乳腺癌細(xì)胞中促進(jìn)hTERT的表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)端粒酶活性
        小結(jié)
    第二部分：ZEB1增強(qiáng)端粒酶的活性，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖
        結(jié)果
        小結(jié)
    第三部分：ZEB1促進(jìn)hTERT啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，E-box結(jié)合序列可能未發(fā)揮作用
        結(jié)果
        小結(jié)
    第四部分：ZEB1與共激活因子 YAP 結(jié)合發(fā)揮促hTERT轉(zhuǎn)錄作用
        結(jié)果
        小結(jié)
    第五部分：ZEB1在機(jī)體內(nèi)對(duì) hTERT的表達(dá)呈正向調(diào)控作用
        結(jié)果
        小結(jié)
討論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
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【參考文獻(xiàn)】

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1 Minal Garg;;Epithelial-mesenchymal transition-activating transcription factors-multifunctional regulators in cancer[J];World Journal of Stem Cells;2013年04期

本文編號(hào)：2841750