【摘要】：髖部骨折是老年人最常見的骨質(zhì)疏松性骨折之一,其發(fā)病率隨著我國人口老齡化進程正迅速持續(xù)增高。大量臨床資料表明,肺部感染是老年人髖部骨折術后最常見的并發(fā)癥之一,而由肺部感染導致的多器官功能衰竭則是最常見的死亡原因。創(chuàng)傷及手術打擊導致的機體免疫功能障礙與肺部感染、膿毒血癥及多器官功能衰竭等并發(fā)癥的發(fā)生密切相關。創(chuàng)傷后免疫功能障礙通常表現(xiàn)為免疫細胞抗原識別、抗原遞呈、T細胞活化及炎癥因子分泌等生物學過程受到明顯抑制,機體清除病原菌的能力降低,感染易感性增加,容易發(fā)生肺部感染、膿毒血癥及多器官功能衰竭等嚴重并發(fā)癥。老年人由于衰老所致的免疫代償能力減弱,在遭受創(chuàng)傷及手術打擊時,發(fā)生免疫抑制的可能性更大,程度往往也更重,更容易罹患感染性并發(fā)癥而死亡。目前關于創(chuàng)傷后免疫抑制的相關研究大多只是觀察到一種現(xiàn)象,缺乏機制性研究及有效的干預手段,且國內(nèi)外針對老年群體創(chuàng)傷后免疫抑制的研究十分罕見,這與目前全球人口老齡化特征不符,因此,探索老年髖部骨折術后免疫功能抑制的分子機制,尋找新的可能的干預靶點,無疑對降低術后肺部感染及死亡率具有重要意義。程序性死亡受體1(Programmed death-1,PD-1)是機體一種重要的免疫抑制分子,主要表達于T細胞表面,對T細胞功能起負調(diào)控作用。大量研究已表明,PD-1在腫瘤、慢性病毒感染及膿毒血癥所引起的免疫抑制過程中起著舉足輕重的作用,體內(nèi)及體外實驗均證實將PD-1基因敲除或給予抗PD-1抗體可明顯逆轉(zhuǎn)T細胞功能衰竭,維持T細胞功能,提高存活率,且阻斷PD-1的藥物在臨床上已經(jīng)用于提高晚期惡性腫瘤患者的免疫功能,并獲得良好的結(jié)果,但PD-1在創(chuàng)傷術后免疫抑制和感染并發(fā)癥中的具體作用及分子機制尚不明確。因此我們假設:髖部骨折和手術可導致老年機體出現(xiàn)免疫功能障礙,T細胞PD-1表達增加,從而抑制T細胞應答,降低機體免疫功能及細菌清除率,感染易感性增加;如果給予抗體阻斷PD-1,則有可能逆轉(zhuǎn)術后免疫抑制,促進機體抗感染能力的恢復,降低肺部感染率及死亡率。1.1建立老年股骨近端骨折+股骨髓內(nèi)針內(nèi)固定術動物模型,了解老年髖部骨折術后免疫炎癥反應及細菌易感性的變化。1.2明確臨床中老年髖部骨折患者圍手術期外周血t細胞pd-1表達變化,分析其與感染并發(fā)癥的關系。1.3明確pd-1阻斷劑對提高老年髖部骨折術后免疫功能、恢復t細胞功能,降低感染率及死亡率的作用。2.方法2.1通過c臂定位下閉合打砸法建立股骨近端骨折大鼠模型,采用切開復位克氏針內(nèi)固定術模擬股骨髓內(nèi)針內(nèi)固定術,分別于術后第1、3、5天檢測動物外周血炎癥因子(tnf-α、il-1β、il-6、il-10)水平、支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度及炎癥細胞計數(shù)(總細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞)、肺組織casepase-3活性、肺組織病理檢查及損傷評分。然后分別于術后第1、3、5天氣管內(nèi)人工接種銅綠假單胞菌菌液,接種后24小時觀察血液及支氣管肺泡灌洗液中細菌負荷和14天死亡率。2.2收集我科2013年8月至2014年6月間老年股骨粗隆間骨折患者共119例,通過流式細胞術檢測入院后第1天、術后第1天、術后第3天及術后第5天外周t細胞pd-1表達。2.3復制小鼠髖部骨折+股骨髓內(nèi)針內(nèi)固定術模型,術后立即給予pd-1阻斷劑干預,采用流式細胞術和免疫熒光法檢測小鼠脾和肺組織pd-1表達和t細胞凋亡情況,elisa檢測外周血炎癥因子表達(ifn-γ、il-10、il-2);對損傷后接受pd-1阻斷劑干預的小鼠實施人工感染銅綠假單胞菌菌液,24小時后評估細菌負荷并觀察14天死亡率。3.結(jié)果3.1老年大鼠股骨近端骨折+股骨髓內(nèi)針內(nèi)固定術模型操作簡單、可控,成功率高,術后14天成活率可達90%,變異浮動較小。髖部骨折及髓內(nèi)針手術打擊可導致老年大鼠在術后早期(1-3天)出現(xiàn)明顯的全身免疫炎癥反應和肺損傷,表現(xiàn)為血漿炎癥因子(il-6、tnf-α、il-1β、il-10)水平明顯增高,支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度和炎癥細胞計數(shù)(巨嗜細胞、淋巴細胞、中性粒細胞)顯著增加,肺組織casepase-3活性增強及明顯的病理改變,但以上改變具有一定的自限性,無干預情況下至術后第7天基本恢復正常。老年大鼠髖部骨折術后第1天和第3天細菌易感性明顯增高,表現(xiàn)為在該時間點給予人工氣管滴注銅綠假單胞菌后,血液及支氣管肺泡灌洗液中的細菌負荷顯著增加,且14天存活率明顯降低。3.2老年髖部骨折患者髓內(nèi)針內(nèi)固定術后外周血t細胞pd-1表達明顯增高,至術1.目的后第5天仍未降至術前水平;有感染并發(fā)癥的老年髖部骨折患者術后外周血T細胞PD-1表達持續(xù)增高,術后第3天達高峰,至術后第5天仍未降至術前水平,而無感染并發(fā)癥患者外周血T細胞PD-1表達僅在術后第1天呈一過性增高。術后第3天與術后第1天T細胞PD-1表達的差值(PD-1D3-D1)預測術后28天內(nèi)感染并發(fā)癥發(fā)生的敏感性和特異性均較高,大于3.4%時具有良好的預警價值。3.3髖部骨折及手術打擊可明顯增高老年小鼠脾臟及肺臟CD3+T細胞PD-1表達,及T淋巴細胞凋亡,提前經(jīng)鼠尾靜脈給予抗PD-1抗體可明顯降低PD-1表達并抑制淋巴細胞凋亡;抗PD-1抗體可顯著提高老年小鼠髖部骨折術后的抗感染能力,減輕免疫抑制程度,部分恢復T細胞分泌功能;抗PD-1抗體可明顯降低老年小鼠髖部骨折術后銅綠假單胞菌感染后支氣管肺泡灌洗液及血液中細菌負荷,14天存活率從25%-33.3%提升至58.3%。4.結(jié)論4.1髖部骨折及髓內(nèi)針內(nèi)固定術可導致老年大鼠術后早期(1-3)天出現(xiàn)全身炎癥反應和肺損傷,同時免疫功能受損、細菌易感性增加。4.2老年髖部骨折患者髓內(nèi)針內(nèi)固定術后外周血T細胞PD-1表達增高,術后第3天與術后第1天T細胞PD-1表達的差值(PD-1D3-D1)或許是預測術后感染并發(fā)癥的可靠指標。4.3 PD-1阻斷劑可有效提升老年小鼠髖部骨折術后免疫功能,部分恢復T細胞功能,降低細菌易感性及死亡率。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R687.3
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 老年大鼠髖部骨折術后免疫炎癥反應及肺部感染易感性變化
    2.1 老年大鼠股骨近端骨折及股骨髓內(nèi)針內(nèi)固定術模型制備
        2.1.1 材料與方法
        2.1.2 實驗結(jié)果
    2.2 髖部骨折及手術打擊對老年大鼠全身和局部免疫炎癥反應的影響
        2.2.1 材料與方法
        2.2.2 實驗結(jié)果
    2.3 髖部骨折及手術打擊對老年大鼠肺部感染易感性的影響
        2.3.1 材料與方法
        2.3.2 實驗結(jié)果
    2.4 小結(jié)
第三章 老年髖部骨折患者PD-1 表達變化及其與感染并發(fā)癥關系
    3.1 材料與方法
    3.2 實驗結(jié)果
    3.3 小結(jié)
第四章 PD-1 阻斷劑在老年小鼠髖部骨折術后肺部感染易感性中的作用
    4.1 材料與方法
    4.2 實驗結(jié)果
    4.3 小結(jié)
全文討論
全文總結(jié)
參考文獻
文獻綜述一
    參考文獻
文獻綜述二
    參考文獻
附錄
攻讀學位期間的研究成果
致謝

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