【目的】脊髓損傷臨床修復(fù)面臨難題,再髓鞘化是修復(fù)的主要瓶頸之一,本課題通過脂質(zhì)體介導(dǎo)音猥因子(Sonic Hedgehog,SHH)基因轉(zhuǎn)染大鼠激活態(tài)雪旺細(xì)胞,過表達(dá)音猥因子并增強(qiáng)激活態(tài)雪旺細(xì)胞增殖和表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的活性,將其移植于損傷局部,探討音猥因子和激活態(tài)雪旺細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的有效性,并分析兩者促進(jìn)損傷后軸突髓鞘化的協(xié)同作用及其機(jī)制�！痉椒ā矿w外研究1.激活態(tài)雪旺細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定和基因轉(zhuǎn)染:選擇出生4-6天SD(Sprague Dawley)大鼠,預(yù)結(jié)扎坐骨神經(jīng)激活雪旺細(xì)胞(Schwann Cells,SCs),1周后切取損傷神經(jīng),分離培養(yǎng)、純化SCs,S100免疫熒光鑒定,保證純度95%,未預(yù)結(jié)扎坐骨神經(jīng)分離獲得未激活SCs作為對(duì)照。pEGFP-N1-SHH表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建并進(jìn)行驗(yàn)證,脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1-SHH和空載質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染激活態(tài)雪旺細(xì)胞(Activated Schwann Cells,ASCs),流式細(xì)胞分選綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)表達(dá)陽性細(xì)胞。2.細(xì)胞活性檢測(cè):流式分選后對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)染色觀察細(xì)胞增殖情況,轉(zhuǎn)染后不同時(shí)期酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè)SHH因子及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)的表達(dá)情況。Ⅰ組為未激活SCs組,Ⅱ組為未轉(zhuǎn)染的ASCs組,Ⅲ組為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的ASCs(Vector-ASCs,V-ASCs)組,Ⅳ組為轉(zhuǎn)染SHH基因的ASCs(SHH-ASCs,S-ASCs)組。體內(nèi)研究1.大鼠脊髓損傷模型制備及分組:8-10周齡雌性SD大鼠,共計(jì)216只,IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)打擊系統(tǒng)制作胸10(Thoracic 10,T10)節(jié)段脊髓打擊模型,A組為DMEM移植組,B組為ASCs移植組,C組為S-ASCs移植組。2.細(xì)胞移植和行為學(xué)評(píng)價(jià):SCI后1周損傷局部細(xì)胞移植。SCI后和移植后當(dāng)天,SCI后每2周到第12周,每組8只,進(jìn)行BBB評(píng)分(Basso,BeattieBresnahan locomotor rating scale)對(duì)各組大鼠后肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)估。3.SCI后局部SHH因子表達(dá):SCI后第2、4、8、12周,每組8只,SCI中心5mm節(jié)段,組織蛋白抽提試劑(Tissue Protein Extraction Reagent,T-PER)聯(lián)合超聲裂解提取總蛋白,二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)法總蛋白定量,ELISA法測(cè)定SHH因子表達(dá)水平。4.SCI后局部軸突改變:SCI后第12周,每組8只,SCI中心行神經(jīng)絲蛋白200(Neurofilament Protein 200,NF200)免疫熒光染色,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核染,軸突計(jì)數(shù),觀察脊髓損傷局部軸突改變情況。5.損傷局部神經(jīng)細(xì)胞增生及分化:SCI后第2、12周,每組8只,SCI中心分別行巢蛋白(Nestin)、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-2(Oligodendrocyte transcription factor-2,Olig2)(增加損傷中心周圍白質(zhì))、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)免疫熒光染色,DAPI核染,細(xì)胞計(jì)數(shù),觀察脊髓損傷局部神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化。6.損傷局部白質(zhì)及髓鞘變化:SCI后第4、12周,每組8只,SCI中心快藍(lán)(Luxol fast blue,LFB)髓鞘染色,計(jì)算白質(zhì)面積比例、髓鞘面積比例,觀察脊髓損傷局部白質(zhì)、髓鞘變化。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)采用SPSS 20.0軟件完成,數(shù)據(jù)均使用`X±S表示。多組均數(shù)之間采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),并利用LSD法進(jìn)行多組均數(shù)之間的兩兩顯著性檢驗(yàn);兩組均數(shù)之間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�！窘Y(jié)果】體外研究1.細(xì)胞增殖觀察:EdU染色發(fā)現(xiàn)Ⅳ組(S-ASCs,26.17±4.03%)染色陽性率最高,Ⅱ組(ASCs,20.41±3.16%)和Ⅲ組(V-ASCs,19.34±2.82%)其次,Ⅰ組(SCs,11.86±2.98%)最低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.SHH、BDNF和NGF的表達(dá):Ⅰ組和Ⅱ組經(jīng)傳代、Ⅲ組和Ⅳ組經(jīng)流式分選后培養(yǎng)1、2、4、6、8周,不同時(shí)期SHH、BDNF和NGF的表達(dá),Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組均高于Ⅰ組,其中Ⅳ組表達(dá)水平最高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。體內(nèi)研究1.行為學(xué)評(píng)價(jià):SCI后第2周到第12周各組大鼠后肢功能都有恢復(fù),SCI后第12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),C組(16.13±2.03分)最高,B組(13.50±1.77分)其次,A組(9.25±1.58分)最低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2.SCI后局部SHH因子的表達(dá):SCI后第2、4周,C組表達(dá)水平最高,B組其次,A組最低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),第8、12周,3組表達(dá)水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.05),基本接近正常大鼠脊髓表達(dá)水平。3.SCI后局部軸突改變:SCI后第12周,SCI中心軸突(NF200陽性)計(jì)數(shù)C組(55.13±12.16根/視野)最多,B組(23.63±8.75根/視野)其次,A組(10.50±5.58根/視野)最少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.SCI后局部神經(jīng)細(xì)胞增生及分化:SCI后第2、12周,SCI中心神經(jīng)干細(xì)胞(Nestin~+細(xì)胞)、損傷中心和周圍白質(zhì)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(Olig2~+細(xì)胞)計(jì)數(shù)C組最多,B組其次,A組最少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),各組內(nèi)比較,隨時(shí)間延長無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.05);SCI后第2周,SCI中心星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP~+細(xì)胞)計(jì)數(shù)B組和C組多于A組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),至第12周C組最少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。5.SCI后局部白質(zhì)及髓鞘變化:SCI后第4到第12周,各組大鼠白質(zhì)面積比例基本穩(wěn)定無改變,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.05),白質(zhì)髓鞘面積比例B組和C組明顯增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P?0.05);兩個(gè)時(shí)間,白質(zhì)面積、髓鞘面積比例C組最大,B組其次,A組最小,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)�！窘Y(jié)論】1.脂質(zhì)體介導(dǎo)SHH表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染激活態(tài)雪旺細(xì)胞可過表達(dá)SHH因子,強(qiáng)化激活A(yù)SCs,促進(jìn)細(xì)胞增殖,并促進(jìn)BDNF和NGF的表達(dá),且可維持至轉(zhuǎn)染后6周以上。2.亞急性期脊髓損傷局部移植SHH基因轉(zhuǎn)染強(qiáng)化激活的ASCs,比較單純ASCs和DMEM,可以更好的促進(jìn)大鼠損傷局部軸突髓鞘化、保護(hù)軸突,獲得后肢功能的恢復(fù),確定聯(lián)合SHH因子和ASCs移植修復(fù)SCI的有效性。3.SHH因子可強(qiáng)化激活A(yù)SCs且轉(zhuǎn)染細(xì)胞可成功表達(dá)SHH因子,兩者聯(lián)合既提供外源性移植細(xì)胞,又激活內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞,增加神經(jīng)干細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞,協(xié)同促進(jìn)軸突髓鞘化,保護(hù)軸突,進(jìn)一步支持髓鞘化和功能恢復(fù)的相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R651.2
【部分圖文】：

的形態(tài)呈現(xiàn)長梭形，2 極居多，也有部分細(xì)胞表現(xiàn)為 3 極，極少有ASCs、V-ASCs 和 S-ASCs 3 組和 SCs 組在外形上無明顯差異，也多，但在相同視野下，3 極細(xì)胞比未激活 SCs 多，部分區(qū)域可見到的細(xì)胞，每代始終形態(tài)上相近。方式上，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，達(dá)到一定密度后，SCs 停止增殖，力不佳，而 ASCs、V-ASCs 和 S-ASCs 3 組在相同密度下，仍能繼形態(tài)保持不變，但是 ASCs 和 V-ASCs 經(jīng)歷 8 代后、S-ASCs 經(jīng)歷胞形態(tài)和生長方式上同原代 SCs 基本相同。 染色鑒定 SCs 和 ASCs，純度達(dá)到 95% 以上（附錄 3）。U 染色觀察細(xì)胞增殖活性生長期細(xì)胞 EdU 染色觀察細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)Ⅳ組（S-ASCs）染（26.17±4.03%），Ⅱ組（ASCs）和Ⅲ組（V-ASCs）其次（20.41±32%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），Ⅰ組（SCs，11.86±2.98%）最低，具有統(tǒng)計(jì).05）（圖 1、附錄 4）。

表 1 培養(yǎng)細(xì)胞 SHH 表達(dá)（單位：ng/ml）時(shí)間（周）Ⅰ組 Ⅱ組 Ⅲ組 Ⅳ組 F1 0.16±0.11 0.47±0.0710.46±0.1011.77±0.09 463.177*2 0.20±0.09 0.58±0.0810.52±0.0811.36±0.08 289.174*4 0.17±0.05 0.61±0.0910.58±0.0911.16±0.09 203.879*6 0.11±0.10 0.70±0.09 0.58±0.07 0.88±0.12 95.736**8 0.11±0.10 0.67±0.1310.61±0.0810.68±0.08160.226***P<0.01；1比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）

表 2 培養(yǎng)細(xì)胞 BDNF 表達(dá)（單位：ng/ml）時(shí)間周）Ⅰ組 Ⅱ組 Ⅲ組 Ⅳ組 F1 0.29±0.1610.54±0.1620.42±0.181,22.92±0.18 447.737*2 0.39±0.13 0.82±0.22 0.62±0.12 2.36±0.24 183.532*4 0.35±0.15 1.06±0.1711.04±0.2412.25±0.18 139.209*6 0.30±0.10 1.43±0.17 1.27±0.09 1.77±0.15 180.941*8 0.26±0.06 1.60±0.251,21.41±0.2111.73±0.192100.461*P<0.01；1,2比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2832184