目的Extracellular signal-regulated kinase(ERK)5作為調(diào)控成骨細(xì)胞增殖的重要細(xì)胞因子,但對(duì)其上游下游影響因子的研究目前還比較匱乏。本論文以ERK5入手,發(fā)現(xiàn)并研究其上游因子NFATc1(Nuclear factor of activated T-cells c1)和ERK5之間的關(guān)系,同時(shí)探討通過何種信號(hào)通路的作用達(dá)到促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和功能發(fā)揮。方法對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),給予流體剪切力(FSS,12dyn/cm~2)、XMD8-92(5μM,特異性ERK5抑制劑)、CsA(NFATc1抑制劑)或EGF(20ng/ml)刺激,用western blot檢測NFATc1、ERK5、p-ERK5、E2F2、cyclin E1、BMP7蛋白水平變化,用免疫熒光技術(shù)檢測ERK5、p-ERK5以及NFATc1亞細(xì)胞定位,用MTT檢測成骨細(xì)胞活性,用PCR array檢測相關(guān)蛋白在不同干預(yù)條件下mRNA表達(dá)水平。結(jié)果對(duì)成骨細(xì)胞加載12dyn/cm~2流體剪切力后,成骨細(xì)胞中ERK5被磷酸化,形成p-ERK5的活化狀態(tài),同時(shí)NFATc1表達(dá)量顯著提升,通過分別給予XMD8-92以及CsA后,發(fā)現(xiàn)CsA能抑制NFATc1表達(dá)的同時(shí)抑制ERK5磷酸化,但XMD8-92僅能抑制ERK5磷酸化,而無法抑制NFATc1表達(dá)。另外,CsA能夠抑制NFATc1核轉(zhuǎn)位,同時(shí)也能使p-ERK5核轉(zhuǎn)位顯著降低,但XMD8-92對(duì)NFATc1無影響,顯然NFATc1通過磷酸化ERK5,使p-ERK5發(fā)生核轉(zhuǎn)位。同時(shí)通過對(duì)增殖相關(guān)因子檢測,發(fā)現(xiàn)在流體剪切力正性調(diào)控NFATc1和ERK5時(shí),E2F2和cyclin E1表達(dá)量能被顯著提升,而且CsA和XMD8-92均能抑制這一作用以及成骨細(xì)胞活性。此外,用CsA和XMD8-92抑制NFATc1和ERK5活化后,BMP7表達(dá)量有顯著降低。結(jié)論NFATc1介導(dǎo)流體剪切力對(duì)ERK5的活化,NFATc1是ERK5的上游因子,同時(shí)NFATc1能磷酸化ERK5促使p-ERK5入核發(fā)揮功能。NFATc1-ERK5信號(hào)通路通過E2F2和cyclin E1促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。并且NFATc1-ERK5信號(hào)通路介導(dǎo)FSS促進(jìn)BMP7表達(dá)。
【學(xué)位單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R68
【部分圖文】：

FSS促進(jìn)NFATc1表達(dá)

蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 NFATc1-ERK5 通路介導(dǎo) FSS 促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和 BMP7 表達(dá)后，給予 EGF 干預(yù)，western blot 檢測 NFATc1 表達(dá)。（B）定量分析 NFATc1/β-actin比值。（C）FSS 以及伴或不伴有 CsA 預(yù)刺激對(duì) NFATc1 表達(dá)的影響。（D）定量分析 NFATc1/β-actin 比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3，*p㩳0.05，**p㩳0.01，***p㩳0.001。3.2 ERK5 能被 FSS 磷酸化活化

B），這與前期研究結(jié)果相符。ATc1 介導(dǎo) FSS 磷酸化 ERK5研究 NFATc1 與 ERK5 在成骨細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系，分別給予 5μM XMD8-92 1h 干預(yù)。如圖所示，F(xiàn)SS 提升 NFATc1 表達(dá)這兩者的上調(diào)均能夠被 CsA 所抑制，但 XMD8-92 僅能抑制降低 NFATc1 表達(dá)水平（p＜0.001，如圖 2C, E）。顯然，N5 在 FSS 作用下的磷酸化過程，NFATc1 是 ERK5 上游因子。不同 XMD8-92 干預(yù)時(shí)程是否對(duì) NFATc1 產(chǎn)生影響，我們給92 不同干預(yù)時(shí)間（1h、2h 和 3h）刺激以檢測 NFATc1 和 p- XMD8-92 干預(yù) 1h，p-ERK5 水平就會(huì)明顯降低（p＜0.001，預(yù)時(shí)間延長，p-ERK5 進(jìn)行性降低（p＜0.001，如圖 2F, H）沒有明顯變化。因此，NFATc1 表達(dá)不會(huì)受 XMD8-92 影響S 促進(jìn) ERK5 磷酸化是通過 NFATc1 實(shí)現(xiàn)的。

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本文編號(hào)：2820206