【摘要】：腦組織短暫缺血即可引起嚴重的急性腦損傷,而恢復血流灌注后,其功能不但未能恢復,還會在血流恢復過程中啟動一系列復雜級聯(lián)反應造成神經(jīng)細胞的凋亡、壞死,導致延遲性神經(jīng)功能障礙,稱為腦缺血再灌注損傷(Ischemia-ReperfusionInjury,IRI)。腦 IRI 引起的延遲性神經(jīng)功能障礙將給患者及家庭帶來巨大的精神痛苦和經(jīng)濟負擔。臨床上神經(jīng)外科手術(shù)、心血管大手術(shù)、休克和心跳驟停等危重病人搶救過程中,均有發(fā)生潛在急性缺血再灌注腦損傷的危險。目前,對于腦IRI的治療臨床上缺少有效藥物,因而圍術(shù)期的腦保護具有重要臨床意義。近年來,大量研究表明:炎性反應誘導的神經(jīng)細胞凋亡是腦IRI的重要機制。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinase/protein kinaseB,PI3K/Akt)通路是與炎癥、細胞凋亡有關(guān)的重要信號傳導通路。PI3K激活時生成PIP3,后者可激活下游Akt,通過其活化形式p-Akt,產(chǎn)生神經(jīng)生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制神經(jīng)元凋亡;PI3K/Akt還可以調(diào)控其下游信號分子如NF-kB、Bax、Bcl-2等蛋白的活化及表達,從而抑制炎性反應和凋亡的發(fā)生,促進細胞存活。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是目前臨床常用的新型麻醉輔助藥。近年來研究發(fā)現(xiàn),Dex可減少腎小管上皮細胞及心肌細胞的凋亡,在圍術(shù)期對缺血再灌注誘導的心腎等臟器損傷有一定保護作用;在膿毒癥患者鎮(zhèn)靜過程中還能減少促炎因子的釋放,減輕炎癥反應發(fā)揮臟器保護作用。以上研究顯示右美托咪定具有抗炎抗凋亡效應。據(jù)此我們提出假設(shè),IRI時Dex可提供腦保護作用,改善患者神經(jīng)功能。本研究內(nèi)容包括以下兩個方面:(1)在整體動物水平,檢驗急性腦IRI時Dex是否可以減少炎癥反應和凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護作用;(2)在體外細胞水平,探討PI3K/Akt/NF-kB通路是否參與了 Dex的神經(jīng)保護效應。具體如下:第一部分:Dex對大鼠缺血再灌注腦損傷的神經(jīng)保護作用目的:動物在體實驗評估Dex對大鼠急性局灶性缺血再灌注腦損傷的神經(jīng)保護作用。方法:60只SPF級健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)(Sham)組,腦缺血再灌注(I/R)組和Dex干預(D+I/R)組。腦缺血再灌注組和Dex干預組采用右側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)lh再灌注24h建立局灶性腦缺血再灌注動物模型,Dex干預在缺血后即刻給予。再灌注24h后Longa評分法及提高軀體擺動實驗(BEST)檢測大鼠神經(jīng)功能缺陷并測定腦水腫程度;HE染色觀察海馬組織病理形態(tài)學變化;TUNEL熒光染色檢測海馬組織細胞凋亡水平;免疫組化染色檢測海馬CA1區(qū)的NF-kBp65蛋白陽性表達;Elisa和RT-PCR法分別檢測海馬組織中炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的水平和mRNA表達;Western Blot免疫印跡法檢測海馬中Bcl-2、Bax、p-Akt蛋白的表達水平。結(jié)果:1.1 Dex對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能和腦水腫損傷的影響:與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注組大鼠神經(jīng)功能評分、左側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)百分比及腦水腫程度均明顯增加,出現(xiàn)急性神經(jīng)功能缺失;Dex干預組大鼠神經(jīng)功能缺陷明顯緩解,腦水腫程度也明顯減輕,各檢測指標均低于腦缺血再灌注組大鼠,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。1.2 Dex對缺血再灌注大鼠海馬組織病理形態(tài)改變的影響:HE染色顯示腦缺血再灌注組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞呈不同程度損傷性改變,細胞層次不清,排列散亂,細胞數(shù)量減少,部分神經(jīng)元皺縮,核固縮、深染,核仁不清晰,以CA1區(qū)細胞變化最為明顯;而Dex干預組大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細胞病理形態(tài)變化明顯減輕。1.3 Dex對缺血再灌注大鼠海馬組織中細胞凋亡的影響:腦缺血再灌注組大鼠海馬組織TUNEL陽性(綠色熒光)細胞明顯增多;Dex干預組與腦缺血再灌注組相比,大鼠海馬組織TUNEL陽性細胞明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。1.4 Dex對缺血再灌注大鼠海馬組織炎性因子水平的影響:腦缺血再灌注組大鼠海馬組織中炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的水平和mRNA表達均明顯高于假手術(shù)組;與腦缺血再灌注組比較,Dex干預組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平及mRNA表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意、義(P0.05)。1.5 Dex對缺血再灌注大鼠海馬組織Bax和Bcl-2表達水平的影響:同假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白表達水平顯著降低,Bax蛋白表達水平明顯上調(diào)(P0.01),差異有統(tǒng)計學意義;而Dex干預組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白表達水平高于缺血再灌注組大鼠(P0.05),Bax蛋白表達水平明顯低于缺血再灌注組大鼠(P0.01)。1.6 Dex對缺血再灌注大鼠海馬組織中NF-kBp65蛋白陽性表達的影響:腦缺血再灌注組大鼠海馬CA1區(qū)NF-kBp65蛋白陽性表達細胞明顯多于假手術(shù)組(P0.01);Dex干預組大鼠海馬CA1區(qū)NF-kBp65蛋白陽性表達細胞明顯低于腦缺血再灌注組大鼠(p0.01)。1.7 Dex對缺血再灌注大鼠海馬組織p-Akt蛋白表達水平的影響:與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組大鼠海馬組織中p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P0.01);Dex干預組大鼠海馬中p-Akt蛋白表達水平顯著上調(diào),是缺血再灌注組大鼠的2.7倍,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。第二部分:PI3K/Akt和NF-κ B通路介導右美托咪定對抗OGD/R誘導海馬神經(jīng)元損傷的機制研究目的:體外細胞實驗探究PI3K/Akt/NF-κ B通路是否介導Dex對IRI的神經(jīng)保護作用。方法:取生后24h內(nèi)SD乳鼠海馬進行體外原代海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)7d,氧糖剝奪復氧復糖再灌注(OGD/R,Oxygen and glucose deprivation/Reperfusion)建立缺血再灌注損傷神經(jīng)元細胞模型,并給予Dex、LY294002(PI3K/Akt阻斷劑)預處理干預。正常對照組(正常培養(yǎng)液及氧濃度培養(yǎng))、OGD/R組(氧糖缺失2h復氧復糖 12h)、D10+OGD/R組(OGD/R前在培養(yǎng)液中加入 10μ M Dex)、LY+D10+OGD/R組(OGD前60min在培養(yǎng)液中加入20μ M LY294002,OGD同時再給予10μ M Dex共同孵育),分別給予不同處理。倒置相差顯微鏡觀察原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細胞形態(tài);CCK-8法檢測細胞活性;AnnexinVFITC/PI雙染流式細胞儀檢測各組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率;Western Blot法檢測海馬神經(jīng)元細胞中Bcl-2、Bax、NF-κ Bp65、Iκ Ba、p-Iκ Ba及總Akt和p-Akt的蛋白表達水平。結(jié)果:2.1海馬神經(jīng)元各期形態(tài)和純度檢測:倒置相差顯微鏡觀察體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元細胞,培養(yǎng)30min時海馬神經(jīng)元為圓形或橢圓形,分散均勻分布。培養(yǎng)20小時后絕大部分細胞均以貼壁狀態(tài)存在,細胞呈梭形、三角形或多角形,部分長出突起。培養(yǎng)3d后海馬神經(jīng)元細胞體積增大呈梭形或不規(guī)則形狀,胞漿較豐富,突起延長。培養(yǎng)至7d時,神經(jīng)元形態(tài)飽滿,胞質(zhì)豐富,突觸更長、更粗,突觸之間互相連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。對培養(yǎng)7d的海馬神經(jīng)元細胞采用FITC-標記的MAP2抗體免疫熒光染色檢測海馬神經(jīng)元細胞純度為91.8%。2.2不同處理對海馬神經(jīng)元細胞活性的影響:體外培養(yǎng)7d的海馬神經(jīng)元,氧糖缺失2h復氧復糖12h后,細胞活性明顯下降,神經(jīng)元生存率達46.3±8.2%,與正常對照組(100%)相比差異顯著(P0.01);10μ M Dex干預使OGD/R海馬神經(jīng)元細胞活性增加到79.8±7.3%(P0.01);與Dex干預OGD/R組相比較,LY294002干預明顯抑制了 Dex對海馬神經(jīng)細胞活性的保護作用,LY+D10+OGD/R組細胞活性降為41.8±4.1%(P0.01);與正常對照組相比,在無OGD/R處理情況下,培養(yǎng)基中加入10uM的Dex和20uM的LY294002對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細胞活性均無明顯影響。2.3不同處理組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率檢測:與正常對照組相比,OGD/R組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率顯著上升(P0.01);與OGD/R組相比,Dex干預組細胞凋亡率明顯下降(P0.01);而給予LY294002和Dex共同干預的OGD/R組海馬神經(jīng)細胞凋亡率明顯高于單純Dex干預的OGD/R組(P0.01)。2.4不同處理組海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax蛋白表達水平檢測:與正常對照組相比,OGD/R組細胞中Bax蛋白表達水平升高,而Bcl-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01);與OGD/R組比較,Dex干預的OGD/R組Bax蛋白表達水平明顯降低,Bcl-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值明顯升高(P0.01);與Dex干預OGD/R組相比,LY294002和Dex共同干預的OGD/R組細胞中Bax蛋白表達水平增加(P0.01),Bc 1-2蛋白表達水平和Bcl-2/Bax比值明顯降低(P0.01)。2.5不同處理組海馬神經(jīng)元細胞中NF-κ B信號途徑活化的檢測:與正常對照組相比較,OGD/R組細胞中NF-κ Bp65蛋白表達及Iκ Ba的磷酸化水平明顯升高,而Iκ Ba水平下降(P0.01);與OGD/R組比較,Dex干預組NF-K Bp65及p-IK Ba的蛋白表達水平均明顯降低(P0.01),Iκ Ba水平升高(P0.01);而給予LY294002和Dex共同干預的OGD/R組,與Dex干預OGD/R組相比,細胞中NF-K Bp65、IK Ba和p-IkBa表達水平變化不明顯(P0.05)。2.6不同處理組海馬神經(jīng)元細胞中PI3K/Akt通路活化的檢測:各組海馬神經(jīng)細胞總Akt表達無明顯差別。與正常對照組細胞相比,OGD/R組海馬神經(jīng)細胞中Akt蛋白的磷酸化水平降低(P0.05);而Dex干預的OGD/R組細胞中p-Akt蛋白的表達水平顯著高于OGD/R組(P0.01);Dex激活Akt的作用可被PI3K抑制劑LY294002完全抑制,LY094002和Dex共同干預OGD/R組神經(jīng)細胞中p-Akt蛋白表達極低(P0.01)。研究結(jié)論1.右美托咪定對缺血再灌注腦損傷具有神經(jīng)保護作用。2.右美托咪定通過抗炎、抗凋亡機制在缺血再灌注腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。3.PI3K/Akt和NF-κ B通路參與了右美托咪定抗缺血再灌注腦損傷的神經(jīng)保護作用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R614

【參考文獻】

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本文編號：2785476