【摘要】：多發(fā)性骨骺發(fā)育不良(multiple epiphyseal dysplasia;MED),是一種罕見的遺傳性骨病,患者以身材矮小和早發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎為主要特征。目前發(fā)現(xiàn),至少有六種不同基因的突變會(huì)導(dǎo)致MED的發(fā)生,孟德爾遺傳方式既有常染色體顯性遺傳也有常染色體隱性遺傳,而COMP基因突變是導(dǎo)致顯性MED發(fā)生的其中一種基因。COMP基因編碼的軟骨寡聚物基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein)是一種分泌型蛋白,主要在軟骨細(xì)胞的周圍基質(zhì)中表達(dá),以維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。COMP單堿基突變導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良的機(jī)制至今仍然不是完全清楚。相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)COMP蛋白在T3結(jié)構(gòu)域突變使蛋白錯(cuò)誤折疊,導(dǎo)致在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)。本研究為了進(jìn)一步研究COMP基因突變導(dǎo)致多發(fā)性骨骺發(fā)育不良的分子機(jī)制,建立了COMP突變的細(xì)胞模型,并進(jìn)行了相關(guān)藥物的篩選研究。1.我們從一個(gè)患有MED的四代家系中,采集患者全血樣本,經(jīng)二代測(cè)序分析和一代測(cè)序驗(yàn)證,確定了一個(gè)COMP基因突變,該突變位于11號(hào)外顯子上即c.1201GA(p.D401N)。2.為了進(jìn)一步研究COMP基因突變致病的分子機(jī)制,我們?cè)诩?xì)胞水平上進(jìn)行了一系列的研究,同時(shí)構(gòu)建了已報(bào)道過的COMP~(D472Y)和COMP~(T585M)。在HeLa細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COMP野生型質(zhì)粒和COMP突變型質(zhì)粒,通過免疫熒光和免疫印跡,發(fā)現(xiàn)與野生型正常分泌的COMP蛋白相比,突變型COMP蛋白滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,影響了蛋白的正常分泌,同時(shí)發(fā)現(xiàn)突變的COMP蛋白與COMP~(D472Y)蛋白的滯留和分泌情況一致,而COMP~(T585M)蛋白滯留和分泌較少,可能是因?yàn)镃OMP~(D472Y)與我們的突變都發(fā)生在COMP蛋白的T3重復(fù)結(jié)構(gòu)域,而COMP~(T585M)發(fā)生在COMP蛋白的C-末端球狀結(jié)構(gòu)域。為了更加明確COMP基因突變對(duì)細(xì)胞的影響,我們構(gòu)建了慢病毒系統(tǒng),轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞,篩選到穩(wěn)定表達(dá)野生型和突變型COMP蛋白的細(xì)胞模型,利用免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與之前瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞現(xiàn)象一致,突變的COMP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上積累,不能正常分泌。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)COMP突變型細(xì)胞較COMP野生型細(xì)胞相比,COMP基因在轉(zhuǎn)錄水平上無差異,說明突變型細(xì)胞中COMP蛋白的滯留主要是由于蛋白的翻譯后水平發(fā)生了改變。3.突變型COMP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上積累引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生異常,這可能與疾病的發(fā)生有很高關(guān)聯(lián)性,利用相關(guān)藥物減少突變型COMP蛋白的積累,有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能,而且對(duì)于疾病的治療有一定的參考價(jià)值。通過對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)研究考證,抗氧化劑乙酰水楊酸和白藜蘆醇能夠緩解突變COMP的滯留,我們利用這兩種藥物作用于建立的細(xì)胞模型,研究發(fā)現(xiàn),在突變細(xì)胞系中,75 mM的乙酰水楊酸和100μM的白藜蘆醇作用24 h,使突變細(xì)胞中滯留COMP減少。綜上所述,本研究建立的COMP突變的細(xì)胞模型證實(shí)了突變型COMP蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生滯留,且蛋白分泌受損,但是COMP基因的表達(dá)水平并沒有發(fā)生變化,證明了蛋白的滯留可能是由于蛋白的錯(cuò)誤折疊。此外,通過藥物篩選實(shí)驗(yàn)證明了乙酰水楊酸和白藜蘆醇對(duì)突變型細(xì)胞具有一定的療效作用。本研究的數(shù)據(jù)為臨床上診斷MED以及用藥提供依據(jù),具有一定的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681
【圖文】：

圖 2.1 先證者的臨床特征及 MED 家系圖譜A）先證者右手和左手的 X-ray 檢查圖像，X-ray 檢查結(jié)果顯示兩側(cè)指骨短而小，遠(yuǎn)端橈尺骨骨骺明顯不規(guī)則分布。（B）正方形指男性，圓形指女性，黑色標(biāo)識(shí)是患病者，箭頭指先證者。Fig. 2.1 Clinical findings and Family pedigree of MED.ight hand and left hand X-ray of the proband, X-ray examination showed bilateral short and small

圖 2.2 COMP 基因測(cè)序分析以及突變位點(diǎn)在 III 型類鈣調(diào)蛋白重復(fù)區(qū)的定位（A）COMP 基因雜合突變?cè)?III-8、III-12 以及 II-5 的患者中被檢出，IV-9 的健康人未發(fā)現(xiàn)此突變。（B）COMP 單體的結(jié)構(gòu)圖。N-末端結(jié)構(gòu)域（NH2），II 型類表皮生長(zhǎng)因子重復(fù)結(jié)構(gòu)域，III 型類鈣調(diào)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，C-末端結(jié)構(gòu)域（COOH）。Fig. 2.2 Sequencing analysis of COMP gene and location of the COMP mutation with thecalmodulin-like repeat domain of COMP.(A) COMP gene heterogenous c.1201C>T (minus strand) was detected in patient lll-12, lll-8, ll-5whilst this mutation is absent in healthy members. (B) The structure of a COMP monomer, showing thelocations of the N-terminal domain (NH2), the EGF-like and calmodulin-like repeats, and theC-terminal domain (COOH), is shown at the top.2.4.3 討論MED 是一種骨骼發(fā)育不良而又很難診斷的疾病，臨床診斷中具有代表性的表型包含風(fēng)濕學(xué)上的關(guān)節(jié)疼痛或者神經(jīng)學(xué)上的肌病，但是最基本的骨骼發(fā)育不良（身材

第三章 COMP 突變蛋白的功能分析SPSS17 軟件分析數(shù)據(jù)顯著性。3.4 結(jié)果與討論3.4.1 COMP 重組質(zhì)粒的突變以及 FLAG 真核表達(dá)載體的構(gòu)建以 GV230-eGFP-COMP 為模板，利用表 3.2 的三對(duì)突變引物，分別進(jìn)行突變，得到 COMP-D401N、COMP-T585M 以及 COMP-D472Y 突變質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果表明三個(gè)突變質(zhì)粒均突變成功，如圖 3.1 所示。野生型的 COMP 和突變成功的 COMP 構(gòu)建于 FLAG 標(biāo)簽的真核表達(dá)載體上。以GV230-eGFP-COMP（COMP-D401N）質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增野生型和突變型 COMP連接在 pcDNAyu-2FLAG-3C 載體上，挑選單克隆菌落，如圖 3.2 酶切鑒定后，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功。A B

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本文編號(hào)：2769337