【摘要】：目的:1.探究酸性環(huán)境對(duì)人椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的影響。2.探究人椎間盤髓核細(xì)胞中是否存在OGR1亞家族受體,酸性環(huán)境是否能激活人椎間盤髓核細(xì)胞中的OGR1亞家族受體。3.探究酸性環(huán)境調(diào)控人椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,為椎間盤退變的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。方法:獲取手術(shù)切除的人體椎間盤,仔細(xì)分離出其中的髓核組織,對(duì)其進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng),相差倒置顯微鏡下觀察人椎間盤髓核細(xì)胞的形態(tài)。將體外培養(yǎng)的細(xì)胞利用瑞氏-吉姆薩、甲苯胺藍(lán)、番紅-O和II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行觀察和鑒定,并將同步生長(zhǎng)的P3代髓核細(xì)胞隨機(jī)分為三組:對(duì)照組用普通培養(yǎng)基(pH值7.4)培養(yǎng),酸性組用酸性培養(yǎng)基(pH值6.8)培養(yǎng)和抑制組用酸性培養(yǎng)基(pH值6.8)+Cucl_2(酸質(zhì)子受體抑制劑)培養(yǎng)。三組髓核細(xì)胞用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,激光共聚焦顯微鏡觀察對(duì)照組和酸性組髓核細(xì)胞DAPI染色后細(xì)胞核的形態(tài)變化。流式細(xì)胞儀測(cè)定對(duì)照組和酸性組髓核細(xì)胞的凋亡率。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)三組髓核細(xì)胞OGR1亞家族受體(OGR1、G2A、TDAG8及GPR4)基因表達(dá)情況。蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測(cè)三組髓核細(xì)胞OGR1、鈣蛋白酶(Calpain)和鈣調(diào)蛋白磷酸酶(Calcineurin)蛋白表達(dá)情況。激光共聚焦顯微鏡觀察酸性刺激對(duì)髓核細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平的影響。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Elisa)測(cè)定三組髓核細(xì)胞培養(yǎng)液中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:相差倒置顯微鏡下觀察人椎間盤髓核組織消化后獲得的細(xì)胞為小球形,細(xì)胞核清楚而明亮,胞漿豐富,漂浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中,有時(shí)也可以見到少數(shù)尚未消化完全而抱在一起的細(xì)胞團(tuán)。原代髓核細(xì)胞貼壁時(shí)間較長(zhǎng),24小時(shí)后有少量細(xì)胞開始慢慢貼壁,7天后絕大部分細(xì)胞完成貼壁,貼壁后的細(xì)胞逐漸伸展變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?細(xì)胞核呈圓形較大,胞漿豐富,內(nèi)含分泌小體。大約7天左右,細(xì)胞間開始有突起互相連接,細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)狀態(tài)。2 3周后,細(xì)胞增長(zhǎng)逐漸加速,出現(xiàn)非�；钴S的增殖及融合,相差倒置顯微鏡下可以見到細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底,增殖活躍處可出現(xiàn)細(xì)胞復(fù)層。與原代髓核細(xì)胞相比,傳代后的髓核細(xì)胞貼壁時(shí)間明顯縮短,約2 3小時(shí),其增殖及融合速度也明顯加快,大約7天后,培養(yǎng)瓶底鋪滿細(xì)胞。體外培養(yǎng)的細(xì)胞瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞呈短梭形或多角形,位于中央的細(xì)胞核為圓形或橢圓形,染成紅紫色,胞漿豐富,染色較淡。細(xì)胞甲苯胺藍(lán)、番紅-O和II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果均為陽(yáng)性,說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞可以分泌糖胺聚糖、蛋白多糖和II型膠原,證實(shí)實(shí)驗(yàn)中體外培養(yǎng)的細(xì)胞為髓核類軟骨細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡觀察髓核細(xì)胞DAPI染色結(jié)果顯示,鏡下可以看到呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的細(xì)胞核。對(duì)照組髓核細(xì)胞的細(xì)胞核為圓形或橢圓形,形態(tài)完整,染色質(zhì)均勻;而酸性組髓核細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)核固縮,核內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣物質(zhì)。流式細(xì)胞儀測(cè)定的對(duì)照組和酸性組的髓核細(xì)胞凋亡率分別為1.03±0.30和37.14±2.14,兩組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,人椎間盤髓核細(xì)胞表達(dá)OGR1、G2A及GPR4mRNA,而TDAG8mRNA未見表達(dá),并且酸性環(huán)境下,OGR1mRNA表達(dá)最為明顯(P0.05);抑制組OGR1mRNA表達(dá)明顯降低(P0.05),而G2A及GPR4mRNA未見明顯變化(P0.05)。激光共聚焦顯微鏡觀察髓核細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平結(jié)果顯示,在受到酸性條件刺激后,對(duì)照組和抑制組的髓核細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平均有升高;對(duì)照組髓核細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)最高熒光強(qiáng)度為4095,而抑制組髓核細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)最高熒光強(qiáng)度為1536,可見酸性刺激可明顯增加細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平,加入抑制劑后,細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平升高受到抑制。Western Blot結(jié)果顯示,酸性環(huán)境下,人椎間盤髓核細(xì)胞表達(dá)OGR1、Calpain和Calcineurin;加入抑制劑后,OGR1、Calpain和Calcineurin的表達(dá)均受到抑制。Elisa結(jié)果顯示,酸性環(huán)境可以抑制髓核細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá),促進(jìn)Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)(P0.05);而加入抑制劑后,可以促進(jìn)髓核細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá),抑制Bax及Caspase-3蛋白表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.酸性環(huán)境可以促進(jìn)人椎間盤髓核細(xì)胞的凋亡。2.人椎間盤髓核細(xì)胞中存在OGR1亞家族受體,并且酸性環(huán)境可以激活人椎間盤髓核細(xì)胞中的OGR1受體。3.酸性環(huán)境下,人椎間盤髓核細(xì)胞中的OGR1受體被激活后,觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)水平升高,激活Ca~(2+)敏感蛋白Calpain和Calcineurin,激活的Ca~(2+)敏感蛋白Calpain和Calcineurin進(jìn)一步抑制Bcl-2蛋白,激活Bax和Caspase-3蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

1.2.2 髓核細(xì)胞的染色觀察及鑒定結(jié)果瑞氏-吉姆薩染色顯示 P1 代髓核細(xì)胞呈短梭形或多角形，位于中央的細(xì)胞核為圓形或橢圓形，被染為紅紫色，，胞漿豐富，染色較淡(圖1.3)；甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞漿豐富，染色較淡，說(shuō)明細(xì)胞可以合成糖胺聚糖(圖1.4)；番紅-O染色顯示細(xì)胞核被染為紅色，胞漿豐富，染色較淡，說(shuō)明細(xì)胞可以合成蛋白多糖 (圖1.5)；II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞核基本不被染色，胞漿豐富呈棕黃色，說(shuō)明細(xì)胞能合成II型膠原，蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞漿仍保持棕黃色(圖1.6)。圖1.5 番紅-O染色(×200) 圖1.6 II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×200 )圖 1.3 瑞氏-吉姆薩藍(lán)染色(×200) 圖 1.4 甲苯胺藍(lán)染色(×200 )圖 1.1 接種 7 天后的細(xì)胞 圖 1.2 接種 21 天后的細(xì)胞

染色較淡(圖1.3)；甲苯胺藍(lán)染色顯示細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞漿豐富，染色較淡，說(shuō)明細(xì)胞可以合成糖胺聚糖(圖1.4)；番紅-O染色顯示細(xì)胞核被染為紅色，胞漿豐富，染色較淡，說(shuō)明細(xì)胞可以合成蛋白多糖 (圖1.5)；II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞核基本不被染色，胞漿豐富呈棕黃色，說(shuō)明細(xì)胞能合成II型膠原，蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核被染為藍(lán)色，胞漿仍保持棕黃色(圖1.6)。圖1.5 番紅-O染色(×200) 圖1.6 II型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×200 )圖 1.3 瑞氏-吉姆薩藍(lán)染色(×200) 圖 1.4 甲苯胺藍(lán)染色(×200 )圖 1.1 接種 7 天后的細(xì)胞 圖 1.2 接種 21 天后的細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R681.5

【參考文獻(xiàn)】

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2 楊強(qiáng);許海委;馬信龍;徐寶山;;組織工程完整椎間盤的構(gòu)建策略及研究進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2016年39期

3 韓超;馬信龍;馬劍雄;王濤;;椎間盤pH值改變對(duì)其細(xì)胞生存代謝影響的研究進(jìn)展[J];中國(guó)脊柱脊髓雜志;2010年04期

本文編號(hào)：2681882