【摘要】：研究背景乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤疾病,發(fā)病后常轉(zhuǎn)移到骨組織中,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移將會導(dǎo)致較差的臨床預(yù)后。由于骨骼細(xì)胞構(gòu)成的特殊性,對化療藥物的攝取常常發(fā)生在非靶點區(qū)域,并在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中產(chǎn)生相似的細(xì)胞毒性。盡管學(xué)者們投入了大量的精力深入研究,但仍無法改變這一現(xiàn)狀。因此,抑制癌細(xì)胞的侵襲性,有效控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,改善轉(zhuǎn)移后的診療效果是我們努力的方向。臨床上對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療方法主要集中在手術(shù)切除、內(nèi)分泌治療、化療和放療等方面。但由于骨骼特殊的病理生理特點,癌細(xì)胞在發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后,可選擇的治療方法有限,治療效果并不理想,臨床預(yù)后也較差。且骨轉(zhuǎn)移通常是多發(fā)轉(zhuǎn)移,因此通過局部放射治療或外科手術(shù)治療是難以徹底消除骨轉(zhuǎn)移病灶。就化療而言,由于骨骼內(nèi)血循環(huán)流量低,全身用藥難以在骨骼部位產(chǎn)生足量的藥物濃度。為維持有效的化療藥物濃度,提高藥物對骨骼轉(zhuǎn)移病灶的治療效果,通常需要加大藥物劑量或者增加給藥次數(shù),二者均可能導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性毒副反應(yīng)。因此,設(shè)計一種具有高選擇性和高效性的藥物遞送系統(tǒng),將抗腫瘤藥物更好地靶向運輸至骨組織中的癌細(xì)胞,以獲得更好的治療效果,成為解決該臨床問題的一大課題。本研究采用八天門冬氨酸(ASP8)和葉酸(FR)設(shè)計了雙重修飾的阿霉素(DOX)脂質(zhì)體遞送藥系統(tǒng)(A/F-LS),其中ASP8能夠靶向骨組織,而葉酸則可進(jìn)一步靶向骨組織中的腫瘤細(xì)胞,二者雙重修飾可有效地將脂質(zhì)體包裹的化療藥物遞送至骨組織中的腫瘤細(xì)胞,并盡可能地減少正常細(xì)胞免受損傷。在試驗中我們制備了DOX-A/F-LS,對其進(jìn)行表征及密度優(yōu)化,研究其藥代動力學(xué),在動物模型體內(nèi)觀察其對動物疼痛、動物生存期的影響及對體內(nèi)細(xì)胞毒性等方面的作用;通過體外試驗觀察其對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響等方面。綜合評估其對骨轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的靶向治療效果,研究結(jié)果為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床治療奠定實驗基礎(chǔ)。目的1.制備雙重修飾的阿霉素脂質(zhì)體,表征并優(yōu)化其密度,以提高DOX-A/F-LS對MDA-MB-231細(xì)胞的選擇性轉(zhuǎn)運的靶向性。2.通過脛骨注射MDA-MB-231細(xì)胞建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型,檢測DOX-A/F-LS在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)、毒性和體內(nèi)治療功效。3.采用細(xì)胞外試驗評價DOX-A/F-LS對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖周期的調(diào)節(jié)、遷移和侵襲能力的抑制作用及細(xì)胞外毒性,評價其抗腫瘤活性。方法1.雙重修飾脂質(zhì)體的制備與密度優(yōu)化:通過合成DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸制備雙重修飾的阿霉素脂質(zhì)體;再對其進(jìn)行表征;采用激光粒子分析儀檢測各種脂質(zhì)體的粒徑大小;應(yīng)用透析法檢測各種脂質(zhì)體制劑的藥物釋放;研究脂質(zhì)體中不同濃度的ASP8與HA的結(jié)合效率,來確定ASP8與葉酸的最優(yōu)配比。2.雙重修飾脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)治療功效與毒性研究:通過脛骨注射MDA-MB-231細(xì)胞建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型,分組按5mg/kg體重的等效劑量,自尾靜脈分別注入游離阿霉素、阿霉素A-LS,阿霉素F-LS和阿霉素A/F-LS,研究其藥代動力學(xué);對小鼠體內(nèi)成像進(jìn)行檢測;對動物疼痛行為進(jìn)行評價;觀察其體重變化及存活時間,從組織病理學(xué)和血象分析開展毒性研究,從而評估阿霉素A/F-LS的安全性。3.雙重修飾脂質(zhì)體細(xì)胞外毒性及靶向性研究:采用體外細(xì)胞試驗的方法,建立細(xì)胞劃痕實驗及侵襲實驗,對比研究阿霉素A/F-LS對MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制作用;并應(yīng)用免疫印跡檢測相關(guān)蛋白參與腫瘤相關(guān)信號通路的抑制作用;應(yīng)用MTT法檢測阿霉素A/F-LS對MDA-MB-231細(xì)胞生長周期的影響作用。結(jié)果1、實驗合成了DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸功能復(fù)合物,觀察到的質(zhì)荷比約為3864.154和3239.984;制備了雙重修飾的DOX-A/F-LS,采用激光粒子分析儀檢測N-LS,A-LS,F-LS和A/F-LS的粒徑大小大約在95.82±0.13nm和96.61±0.11nm之間,顯示N-LS,A-LS,F-LS和A/F-LS的大小不因ASP8或葉酸修飾而受到明顯影響。研究還顯示ASP8修飾的脂質(zhì)體(A-LS)與HA結(jié)合的能力,隨著脂質(zhì)體制劑中ASP8/脂質(zhì)體摩爾比的增加,HA的結(jié)合量也顯著增加,脂質(zhì)體上DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸的最佳密度分別為15%和10%(摩爾比)。2、通過乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型的尾靜脈注射5mg/kg體重的等效劑量游離阿霉素、阿霉素A-LS,阿霉素F-LS和阿霉素A/F-LS,在注射后0.083、0.25、0.5、1,2,3、4,6,8、12和24小時從頸靜脈抽取血樣,顯示脂質(zhì)表面結(jié)合足夠量的ASP8和葉酸并不會損害PEG的體循環(huán)特性;活體成像獲得的數(shù)據(jù)表明A/F-LS系統(tǒng)有可能在細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)藥物對轉(zhuǎn)移骨腫瘤細(xì)胞的特異性靶向轉(zhuǎn)運。在接種腫瘤細(xì)胞后的第4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24天檢測小鼠疼痛相關(guān)的行為,A/F-LS治療組可顯著減少動物退縮次數(shù)(3.25±0.63),可有效減輕動物疼痛水平。組織學(xué)和血液學(xué)的檢測指標(biāo)表明,A/F-LS組只有輕微的肝臟毒性,紅細(xì)胞(RBC)和白細(xì)胞(WBC)水平?jīng)]有明顯下降,顯示A/F-LS在很大程度上減輕了DOX的細(xì)胞毒性,并且在測試劑量下相對安全。在整個實驗期間A/F-LS組小鼠的體重減輕值均小于游離DOX組,延長動物中位生存時間(27天),表明DOX-A/F-LS可通過骨靶向遞送減少非特異性細(xì)胞對其攝取,通過增強腫瘤細(xì)胞對其內(nèi)吞攝取而表現(xiàn)出更強的抗腫瘤活性。3、細(xì)胞外DOX-A/F-LS處理MDA-MB-231細(xì)胞72h后,流式細(xì)胞儀檢測DOX-A/F-LS組S期細(xì)胞顯著降低,其中DOX-A/F-LS 1u M和10u M處理組S期細(xì)胞占比分別為18.98±8.84,13.00±7.14,明顯低于對照組32.56±7.29。細(xì)胞劃痕實驗顯示DOX-A/F-LS(10u M)組實驗細(xì)胞劃痕愈合率為50.36±1.1%,明顯低于空白對照組的79.89±1.60%(P0.05),表明DOX-A/F-LS對MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力有顯著抑制作用。Transwell實驗與對照組對比,結(jié)果顯示DOX-A/F-LS組能有效抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力,高濃度處理組抑制效果更明顯,有顯著的遷移和侵襲抑制效應(yīng)。免疫印跡實驗檢測p-ERK1/2、p-Akt,p-p38蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示DOX-A/F-LS處理組可以顯著抑制ERK1/2、AKT的磷酸化水平,而對于p-p38沒有影響,提示AKT和ERK1/2參與了阿霉素脂質(zhì)體對于MDA-MB-231細(xì)胞增值和遷移的抑制效應(yīng)。MTT方法檢測含有DOX的脂質(zhì)體制劑對細(xì)胞外MDA-MB-231細(xì)胞毒性,DOX-F-LS和DOX-A/F-LS的IC50值分別為17.8lμg/m L和15.3μg/m L,明顯低于對照組IC50值的100.5μg/m L和94.9μg/m L。結(jié)果表明,經(jīng)過葉酸修飾后的阿霉素脂質(zhì)體可顯著抑制細(xì)胞表面葉酸受體過表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞增殖,有助于將藥物進(jìn)一步轉(zhuǎn)運至骨組織中的腫瘤細(xì)胞,增強對骨轉(zhuǎn)移腫瘤的治療效果。結(jié)論1.DOX-A/F-LS的粒徑大小大約在95.82±0.13nm和98.61±0.11nm之間,脂質(zhì)體上ASP8和葉酸的最佳密度分別為15%和10%(摩爾比),可有效提高藥物轉(zhuǎn)運的主動靶向性,降低內(nèi)在超越依賴的EPR效應(yīng)。2.DOX-A/F-LS是理想的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移藥代動力學(xué)模型,適用于通過全身給藥對MDA-MB-231細(xì)胞的靶向藥物遞送,減少對健康細(xì)胞的毒性。3.DOX-A/F-LS在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程中能有效調(diào)節(jié)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖周期,顯著抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力作用,可有效的發(fā)揮抗腫瘤作用。
【圖文】：

修飾而來的。這兩種功能物質(zhì)合成過程如圖1所示。用半胱氨酸終止ASP8以引入游離巰基（-SH），然后通過巰基-馬來酰亞胺反應(yīng)與DSPE-PEG2000-Mal偶聯(lián)，這使得ASP8能夠在特定位點（-SH）綴合（圖1-1 A）。為了制備DSPE-PEG2000-葉酸，我們通過碳二亞胺介導(dǎo)與葉酸偶聯(lián)先制備成DSPE-PEG2000-NH2（圖1-1 B）。MALDI-TOF MS結(jié)果證實了成功合成了DSPE-PEG2000-ASP8和DSPE-PEG2000-葉酸，觀察到的質(zhì)荷比約為3864.154和3239.984（圖1-1 C 和圖1-1 D，由箭頭標(biāo)記），理論質(zhì)荷比分別為3864和3239，然后將最終產(chǎn)物用于制備N-LS、A-LS、F-LS和A/F-LS的靶向脂質(zhì)體。圖1-1 靶向脂質(zhì)體功能結(jié)合物合成（A）:引入游離巰基（-SH）與DSPE-PEG2000-Mal偶聯(lián)，ASP8在特定位點（-SH）綴 合 ；（ B ） : 以 碳 二 亞 胺 介 導(dǎo) 與 葉 酸 偶 聯(lián) 制 備 成 DSPE-PEG2000-NH2 ；（C-D）:MALDI-TOF MS結(jié)果證實合成功能結(jié)合物，觀察質(zhì)荷比。4.2 脂質(zhì)體的表征表1-1總結(jié)了四種不同脂質(zhì)體制劑的理化性質(zhì)。所有脂質(zhì)體的EE（%）值最小在91.7 ± 1.2；最大值在94.5 ± 1.8，四個類型脂質(zhì)體的EE（%）值均大于90%

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文-39-也與使用激光粒子分析儀測定的粒徑相似，見圖1-2（B）。表明雙重修飾后的脂質(zhì)體不會影響藥物遞送系統(tǒng)的作用發(fā)揮，也不會改變其在體內(nèi)、體外被攝取，吸附在血管內(nèi)外和藥物的釋放，從而保證其穩(wěn)定性。圖1-2 脂質(zhì)體表征及藥物釋放性能（A）通過透射電子顯微鏡觀測 A/F-LS 形態(tài)及分布；（B）應(yīng)用 TEM 圖像檢測粒徑大小與激光粒子分析儀測定的比較；（C）采用透析法檢測各種脂質(zhì)體制劑的藥物體外釋放；（D）A/F-LS 用含有 10%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時評估脂質(zhì)體在 10%FBS 中的體外穩(wěn)定性。4.3 脂質(zhì)體藥物的釋放圖1-2（C）顯示的是采用DOX釋放試驗以檢測脂質(zhì)體的藥物釋放性能，結(jié)果顯示，，N-LS，A-LS，F(xiàn)-LS和A/F-LS四種脂質(zhì)體放入含有0.5%Tween-80（w/w）的磷酸鹽緩沖溶液介質(zhì)的透析袋中，在1/2小時、1小時、2.5小時、5小時、7.5小時,10小時等各個時間點
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.9;R738

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2665363