【摘要】：骨缺損是現(xiàn)今臨床工作面臨的重要問題。僅2011年,美國就有超過100萬例外科手術(shù)涉及到骨缺損的修復。目前常用的自體骨移植和異體骨移植受限于來源有限,供體損傷,免疫排斥等問題。因此通過構(gòu)建生物工程骨修復材料對骨缺損處進行修復成為了骨缺損修復的重要方向。水凝膠因其良好的生物相容性與安全性成為了生物工程的重要研究領(lǐng)域。智能水凝膠由于可以對外界產(chǎn)生響應(yīng)性,根據(jù)溫度,pH,壓力等因素產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化成為了微創(chuàng)修復骨缺損的理想材料。其可以通過注射方法到達骨缺損區(qū)域并且在調(diào)控下發(fā)生變化而完成對缺損區(qū)域的填充。人體有著相對穩(wěn)定的pH環(huán)境與溫度,因此具有pH敏感性與溫度敏感性的水凝膠在人體內(nèi)運用具有先天的優(yōu)勢。將種子細胞,誘導因子與智能可注射水凝膠復合有望構(gòu)成理想的生物工程材料。本課題通過體內(nèi)外實驗檢測了兩種智能可注射凝膠作為載成骨分化干細胞骨修復材料的作用與效果。實驗主要分為兩部分:1.復合氧化石墨烯Graphene oxide與PPCN-g獲得溫度敏感性水凝膠GOP。首先通過流變學實驗證GOP在保留溫度響應(yīng)性的同時獲得了較高的彈性模量。熒光顯微鏡與掃描電鏡證實細胞在GOP中粘附良好并在BMP9誘導下可在凝膠內(nèi)產(chǎn)生豐富的膠原及礦化小節(jié)。Gluc檢測證實相比與PPCN-g中,腺病毒感染的iMADs細胞可更穩(wěn)定的長期存在于GOP并持續(xù)表達目標蛋白。堿性磷酸酶檢測發(fā)現(xiàn)BMP9誘導組和對照組中GOP凝膠內(nèi)iMADs堿性磷酸酶都高于PPCN-g組。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)在GOP參與下各階段成骨因子表達明顯增加,且GOP可以增強BMP9介導的成骨分化。裸鼠皮下異位成瘤模型證實GOP凝膠的運用可增強BMP9誘導下的iMADs細胞的體內(nèi)成骨作用。同時免疫組化染色還提示成骨作用的增強除GO本身的成骨誘導能力外可能與其誘導的血管化相關(guān)。2.通過無定形磷酸鈣與羧甲基殼聚糖有機復合形成CMC-ACP納米微粒。CMC-ACP凝膠在具有良好的穩(wěn)定性的同時具備pH響應(yīng)性,可完成自組裝。在人體pH范圍內(nèi),CMC-ACP凝膠具有可注射性和3D打印可行性。將iMADs細胞載入CMC-ACP凝膠內(nèi)培養(yǎng)后通過SEM與熒光顯微鏡觀察我們發(fā)現(xiàn)iMADs細胞可以在凝膠內(nèi)及凝膠表面粘附增殖并產(chǎn)生明顯的礦化。Gluc檢測提示細胞可以在凝膠內(nèi)生存達15天并且持續(xù)表達目的蛋白。此外,CMC-ACP凝膠為細胞提供了成骨分化的有利環(huán)境:堿性磷酸酶染色與鈣鹽沉積染色均提示CMC-ACP凝膠可有效協(xié)同BMP9介導了間充質(zhì)干細胞成骨分化。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)CMC-ACP誘導iMADs細胞成骨分化而抑制了成脂肪分化。這一結(jié)果同樣在裸鼠皮下異位成骨的實驗中得到了驗證:雖然CMC-ACP不足以單獨介導異位成骨的產(chǎn)生,但是可有效協(xié)同BMP9介導的異位成骨:MicroCT顯示BMP9-CMC-ACP組骨塊相比與BMP9-NA組具有高而均勻的骨質(zhì)生成,同時CMC-ACP組具有良好的血管誘導能力。組織學檢測發(fā)現(xiàn)CMC-ACP作為生物支架有效的提高了BMP9介導了成骨能力,在獲得了更多而有序的骨小梁生成和更為豐富的血管長入,抑制了脂肪組織的生成。根據(jù)以上研究我們認為,pH與溫度敏感性可注射凝膠復合BMP9介導的間充質(zhì)干細胞成骨是構(gòu)建具有生物活性的骨修復材料的有效方法。基于智能水凝膠的骨修復材料時為骨缺損的修復提供了一種可行的方向。
【圖文】：

同配比（PPCN-g：GO）GOP 凝膠在溫度變化過程中的粘彈性改The temperature evolution of GOP viscoelastic properties in differ(PPCN-g：GO)彈性檢測測試了加入氧化石墨烯是否會影響 PPCN-g 粘彈性性能。按PPCN-g，置于冰上，檢測不同配比情況下的流變學情況發(fā)改變了 PPCN-g 的粘彈性性能。我們發(fā)現(xiàn)單純 PPCN-g 僅 GOP 混合(1:1 )表現(xiàn)出一種凝膠狀結(jié)構(gòu),這提示 GO 的加入某種化學聯(lián)接而起到了降低液相的作用，但是并沒有改變P 仍然具有良好的可注射性。此外我們發(fā)現(xiàn)通過加入 GO彈性模量：在溫度升高到 40 度的過程中，，PPCN-g 的存儲模GO-P (1:1 PPCN-g：GO)的存儲模量從 8 增加到 309 Pa(圖

24圖 2 GOP/PPCN-g 溫度響應(yīng)性與細胞裝載能力 2 GOP/PPCN-g temperature response and cell loading capac
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R68;R318.08

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本文編號：2664397