【摘要】：第一部分骨肉瘤細(xì)胞中KDM5C與有絲分裂期紡錘體組裝檢查點(diǎn)關(guān)系的研究目的骨肉瘤是骨科疾病中最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤。目前最常用的骨肉瘤化療藥物多柔比星、異環(huán)磷酰胺、順鉑均為非細(xì)胞周期依賴的化療藥物,具有較嚴(yán)重的毒副作用。因此針對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控靶點(diǎn)的新型化療藥物是骨肉瘤研究的重要方向之一。紡錘體組裝檢查點(diǎn)(spindle assembly checkpoint,SAC)作為有絲分裂期的關(guān)鍵調(diào)控之一,其活性能夠被著絲粒附近組蛋白H3第4位賴氨酸殘基的甲基化(histone H3 lysine 4 mono-/di-/trimethylation,H3K4me/me2/me3)抑制,從而促進(jìn)有絲分裂期細(xì)胞從中期向后期的轉(zhuǎn)化,加速細(xì)胞周期進(jìn)程、增加遺傳不穩(wěn)定性。賴氨酸去甲基化酶5C(lysine demethylase 5C,KDM5C),能夠特異性催化H3K4me2/me3的去甲基化,調(diào)節(jié)染色體上H3K4me2/me3的水平。KDM5C與多種腫瘤相關(guān),但KDM5C與骨肉瘤的關(guān)系,尤其是其對(duì)有絲分裂期紡錘體組裝檢查點(diǎn)的影響尚不清楚。本文擬通過(guò)對(duì)多種骨肉瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期同步化,探討KDM5C在骨肉瘤細(xì)胞有絲分裂期的變化及其對(duì)SAC的調(diào)控。方法利用細(xì)胞周期同步化方法,收集不同骨肉瘤細(xì)胞系有絲分裂期各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的細(xì)胞樣品,利用Western blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)KDM5C蛋白質(zhì)含量的變化及其翻譯后修飾與有絲分裂期進(jìn)程的關(guān)系;并用特異性抑制劑CPI-455抑制KDM5C的去甲基化轉(zhuǎn)移酶活性,利用Western blot檢測(cè)有絲分裂期進(jìn)程中抑制KDM5C的去甲基化酶活性對(duì)SAC相關(guān)標(biāo)志蛋白細(xì)胞分裂周期蛋白-27(cell division cycle protein 27,cdc27)、周期蛋白B1(Cyclin B1)的影響。結(jié)果1.在骨肉瘤細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中,與SAC相關(guān)的標(biāo)志蛋白cdc27的磷酸化滯后條帶的位移變化和Cyclin B1的蛋白降解均與文獻(xiàn)報(bào)道相似,但KDM5C蛋白含量無(wú)明顯變化。2.在宮頸癌細(xì)胞HeLa中重復(fù)文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn),但在有絲分裂前中期到G1早期中未觀察到KDM5C蛋白水平的明顯變化。3.為觀察KDM5C翻譯后修飾所構(gòu)建的重組截短體質(zhì)粒,在HEK293T中表達(dá)出相應(yīng)截短體蛋白質(zhì)。4.骨肉瘤細(xì)胞U2OS中檢測(cè)KDM5C截短體的翻譯后修飾,并未觀察到明顯的位移減慢或泛素化降解條帶。5.增加KDM5C去甲基化酶含量或抑制其酶活性,相較對(duì)照組,SAC相關(guān)標(biāo)志蛋白cdc27的去磷酸化曲線和Cyclin B1降解曲線未見(jiàn)明顯變化。6.活細(xì)胞實(shí)時(shí)熒光共聚焦成像結(jié)果顯示,相對(duì)DMSO對(duì)照組,抑制KDM5C酶活性后,SAC相關(guān)的有絲分裂中期向后期進(jìn)程和染色體分離錯(cuò)誤比例無(wú)明顯差異。結(jié)論在骨肉瘤細(xì)胞系有絲分裂期中,KDM5C的蛋白質(zhì)含量不隨有絲分裂期進(jìn)程而改變,抑制其去甲基化酶活性不影響對(duì)SAC的滅活。第二部分抑制KDM5C的去甲基化酶活性對(duì)小鼠成肌細(xì)胞C2C12增殖、分化的影響目的骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中常見(jiàn)的損傷之一,損傷后易導(dǎo)致肌肉組織血腫機(jī)化、瘢痕修復(fù),從而降低骨骼肌的收縮能力,并增加再次損傷的可能,對(duì)患者的運(yùn)動(dòng)能力構(gòu)成了潛在威脅。因此探討影響成肌分化的機(jī)制將有助于為此類骨骼肌損傷疾病提供更好的治療方案。H3K4的甲基化與去甲基化能夠通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá),調(diào)控多種重要的生物學(xué)活動(dòng)。賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶2D(Lysine methyltransferase 2D,KTM2D)屬于KTM2甲基化酶家族成員之一,能夠特異性催化H3K4的單甲基化和二甲基化,小鼠中敲除KTM2D將使成肌分化標(biāo)志蛋白Myogenin(Myo G)、Myosin表達(dá)缺陷,進(jìn)而出現(xiàn)骨骼肌發(fā)育障礙,導(dǎo)致新生小鼠的死亡。目前已知H3K4甲基化水平主要由甲基化酶KTM2家族和去甲基化酶KDM5家族的共同調(diào)節(jié),KDM5C作為去甲基化酶家族KDM5成員之一,具有特異性催化H3K4me3/me2的去甲基化功能,其是否參與調(diào)節(jié)成肌分化過(guò)程仍不清楚。本研究擬通過(guò)使用KDM5C的特異性抑制劑CPI-455抑制其去甲基轉(zhuǎn)移酶活性,分析KDM5C酶活性抑制后對(duì)小鼠成肌細(xì)胞C2C12增殖、分化的影響。方法采用特異性抑制劑CPI-455抑制KDM5C酶活性后,利用Western blot和RT-PCR分別檢測(cè)成肌細(xì)胞分化0h、48h、72h、96h成肌分化標(biāo)志分子的蛋白質(zhì)和m RNA表達(dá)情況。通過(guò)CCK-8、Hoechst 33342活細(xì)胞核染色計(jì)數(shù)檢測(cè)KDM5C酶活性抑制對(duì)小鼠成肌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果1.CPI-455處理組分化48h、72h、96h成肌分化標(biāo)志分子Myosin和Myo G蛋白表達(dá)量均低于同期DMSO處理組,但成肌分化標(biāo)志分子Actin,Alpha 1(ACTA1)的蛋白表達(dá)量則無(wú)明顯差異。CPI-455處理組的H3K4me3和KDM5C的蛋白表達(dá)量均高于同期DMSO處理組。2.CPI-455處理組分化48h、72h、96h成肌分化標(biāo)志分子Myosin、Myo G、ACTA1、Myo D、Myf5、Pax7的m RNA相對(duì)表達(dá)量相較DMSO處理組均無(wú)明顯變化。3.CPI-455處理組相較DMSO處理組KDM5C的m RNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化。4.CCK-8法、Hoechst 33342活細(xì)胞核染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)C2C12細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中CPI-455處理組相較DMSO處理組的相對(duì)細(xì)胞活性或相對(duì)細(xì)胞核數(shù)均無(wú)明顯差異。結(jié)論抑制KDM5C的去甲基化酶活性可通過(guò)下調(diào)成肌分化標(biāo)志分子Myosin和Myo G的蛋白表達(dá)影響C2C12細(xì)胞成肌分化,而對(duì)C2C12細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。
【圖文】：

中 KDM5C 的蛋白質(zhì)含量在 G2 期 有絲分裂前中期的變 KDM5C protein level from G2 phase to prometaphase in cellseLa 中 KDM5C 蛋白含量在有絲分裂期的變]報(bào)道，在宮頸癌細(xì)胞 HeLa 中 KDM5C 蛋白水平呈為驗(yàn)證文獻(xiàn)報(bào)道我們?cè)?HeLa 細(xì)胞中重復(fù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)平的明顯變化（圖 3）。

顯變化（圖 2）。5C 的蛋白質(zhì)含量在 G2 期 有絲分裂前 protein level from G2 phase to prometacells KDM5C 蛋白含量在有絲分裂在宮頸癌細(xì)胞 HeLa 中 KDM5C 蛋白文獻(xiàn)報(bào)道我們?cè)?HeLa 細(xì)胞中重復(fù)相顯變化（圖 3）。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：2662906