【摘要】：目的:肝移植是晚期肝病唯一有效的治療方法。然而,目前在全球范圍內供體器官的短缺意味著許多患者會死于等待不到合適的器官。因此,迫切需要探索晚期肝病的新型治療方案。最近,肝干細胞與前體細胞治療作為肝病的一種治療方案為該疾病的治療帶來了新希望,而成人肝臟中的肝臟前體細胞(HPCs)由于其可能具有再生肝細胞的能力而有望成為治療肝臟疾病的重要來源。已有研究證實干細胞的標志物性別決定基因9(SOX9)和膽管細胞標志物細胞角蛋白7(CK7)可用于鑒定成年小鼠中膽管來源的HPCs群。然而,如何分離HPCs并進行高效率擴增仍然是影響其深入研究以及最終進入臨床試驗的關鍵問題。本研究,我們希望能建立一種簡單、高效的肝前體細胞分離培養(yǎng)方法,能從健康成年小鼠的肝臟中分離出HPCs進行體外克隆擴增以獲得大量且性狀穩(wěn)定的HPCs,并研究擴增所得的HPCs在體內外環(huán)境的分化能力。此外,我們將初步探討HPCs移植至小鼠損傷肝臟后的定植、分化情況。研究顯示,TGF-β在肝損傷和肝纖維化過程發(fā)揮重要作用,最后我們將初步探討TGF-β對HPCs增殖分化的影響。方法:將6-8周健康小鼠的肝臟灌注去紅細胞,采用文獻報道中肺干細胞分離培養(yǎng)方法進行微小調整后分離提取小鼠肝組織內的前體細胞,然后從形成克隆的前體細胞中挑單個克隆進行傳代,擴增得到大量的、穩(wěn)定的細胞群。采用免疫熒光染色技術對擴增后的前體細胞進行鑒定,分別用干細胞標記蛋白SOX9、膽管細胞的標記蛋白CK7、成熟肝細胞的標記蛋白(HNF4α)和白蛋白(Alb)來驗證本研究所分離提取的前體細胞為HPCs(CK7+ SOX9 + HNF4α-Alb-)。采用體外3D培養(yǎng)技術對提取的HPCs進行進一步培養(yǎng),在培養(yǎng)第14天后對其形成的結構進行檢測,通過免疫熒光染色檢測成熟肝細胞標記HNF4α和Alb以研究HPCs在3D培養(yǎng)中的分化情況。同時觀察成纖維細胞生長因子9(FGF9)和肝臟細胞生長因子(HGF)在3D環(huán)境中對HPCs分化的影響。采用腎包膜下細胞注射技術觀察分離提取的HPCs在體內分化情況。在注射后第14天后取材對HPCs在腎包膜下形成的結構進行檢測,同樣通過免疫熒光染色檢測成熟肝細胞標記HNF4α和Alb以研究在體內HPCs的分化情況。同時觀察成纖維細胞生長因子9(FGF9)和肝臟細胞生長因子(HGF),在體內環(huán)境中對HPCs分化的影響。通過腹腔內注射CCL4建立小鼠肝損傷模型。然后采用開腹經(jīng)脾臟注射的方式進行HPCs的肝臟移植,并觀察HPCs在小鼠損傷肝臟中的定植以及定植后的分化情況。為初步探討TGF-β在HPCs增殖和分化中的作用,我們采用TGF-β與其抑制劑SB431542處理HPCs,通過MTT實驗檢測各組處理后HPCs的細胞活性,同時采用定量PCR技術觀察TGF-β對HPCs CK7、SOX9、HNF4α和Alb轉錄水平的影響。結果:本研究成功的從健康成年小鼠肝臟組織中分離提取獲得形態(tài)、大小均一、并能穩(wěn)定的傳代和擴增的前體細胞克隆。進一步鑒定發(fā)現(xiàn)我們提取的前體細胞同時表達CK7和SOX9,不表達HNF4α和Alb,且具有較強的擴增能力,提示本研究所提取的前體細胞為HPCs。此外,該群細胞可在體外進行大量、穩(wěn)定的克隆性擴增,并在不分化的狀態(tài)下進行大量克隆性擴增,即表現(xiàn)出干細胞的增殖特性。發(fā)現(xiàn)該群HPCs能在3D培養(yǎng)環(huán)境中自發(fā)聚集形成類球樣結構,并在球體內形成亞結構。檢測發(fā)現(xiàn)該類球樣結構內的部分HPCs表達成熟肝細胞的標記蛋白HNF4α和Alb,提示HPCs在3D培養(yǎng)環(huán)境中可向肝細胞方向分化。在使用FGF9和HGF處理后,與未處理組相比,表達HNF4α和Alb的HPCs細胞數(shù)明顯增多。在腎包膜下誘導HPCs體內分化的實驗中,我們發(fā)現(xiàn)HPCs也可自發(fā)形成囊狀結構,也可表達HNF4α和Alb,形成的結構大小不一,但均比體外3D培養(yǎng)環(huán)境中所獲球體大。此外,在FGF9和HGF處理后,表達HNF4α和Alb的HPCs細胞數(shù)明顯增多。采用CCl4腹腔注射成功構建小鼠肝損傷模型,并通過經(jīng)脾臟注射的方式將體外克隆性擴增的HPCs移植至小鼠損傷肝臟,并在移植后第7天和第14天都檢測到HPCs在小鼠損傷肝臟中定植,且部分定植HPCs發(fā)生分化。發(fā)現(xiàn)TGF-β對提取HPCs的克隆性生長具有抑制作用,且在TGF-β處理后,HPCs形態(tài)發(fā)生了改變,由類圓形變成梭狀。TGF-β處理后HPCs的相關標志CK7和SOX9轉錄水平增高,HNF4α和Alb轉錄水平降低,提示TGF-β可影響HPCs的分化。此外,在使用TGF-β抑制劑SB431542后TGF-β對HPCs的影響消失。結論:本研究在證實健康成年小鼠肝臟內存在具有干細胞特性的HPCs后,對文獻中報道的肺干細胞分離提取方法進行微小調整后成功從小鼠肝臟中分離出前體細胞且證實該群細胞是膽管來源的細胞,在體外具有較強的擴增能力,并在體內體外均具有向肝細胞分化的能力。該細胞群在體內體外均具有自發(fā)聚集成球的特點,且在體內體外形成的類球結構有利于HPCs向成熟肝細胞分化。此外,本研究證實體外擴增的HPCs可在小鼠損傷肝臟中定植并且具有向肝細胞分化的能力。最后,本研究證實了 TGF-β在HPCs增殖和分化中的抑制作用。本研究為HPCs與肝臟再生之間的關系研究提供了有力的支持,同時也為肝病的細胞治療研究提供了新思路。
【圖文】：

逑物逡逑圖１－１成年小鼠肝臟門靜脈附近存在膽管細胞標志物ＣＫ７邋（紅色）和前體細胞標志逡逑物ＳＯＸ９邋（綠色）共表達的細胞（４０0ｘ邋）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｂｉｌｉａｒｙ邋ｍａｒｋｅｒ邋ＣＫ７（ｒｅｄ）邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ邋ｃｅｌｌ逡逑ｍａｋｅｒＳＯＸ９（ｇｒｅｅｎ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ａｄｕ

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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R657.3

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本文編號：2661795