【摘要】：脊髓損傷目前臨床上仍缺乏有效的治療手段,其傷后神經(jīng)功能修復(fù)問題也是世界性難題,而利用外源性細胞移植替換脊髓中受損的神經(jīng)細胞有望成為治愈脊髓損傷的治療方式。成年個體脊髓中央管膜下來源的神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)作為移植細胞來源治療脊髓損傷時,具備低成瘤性、低免疫排斥反應(yīng)、無倫理道德問題等優(yōu)勢。但是,細胞移植治療脊髓損傷時,常常存在移植細胞數(shù)量不足、移植區(qū)域細胞存活率低等問題。由此可見,如何促進或提高體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的生長、增殖及生存率,對于形成足夠神經(jīng)干細胞數(shù)量用于移植治療脊髓損傷是至關(guān)重要的。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)的神經(jīng)保護作用近年來得到廣泛關(guān)注,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)EPO在體外對于非成年脊髓來源神經(jīng)干細胞具有一定的促進增殖及抗凋亡作用。若EPO也能促進體外培養(yǎng)的成年個體脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞生長、生存,對于下一步進行移植治療將大有裨益。然而,國內(nèi)外有關(guān)EPO對于體外培養(yǎng)成年個體脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞影響的研究鮮有報道,EPO處理的適宜劑量、適宜時間及相關(guān)機制也尚無定論。本課題首先成功從成年大鼠脊髓中央管膜下分離出神經(jīng)干細胞,進而發(fā)現(xiàn)5U/ml和20U/ml的濃度和96h的處理時間可能是發(fā)揮EPO的促增殖、抗凋亡及調(diào)節(jié)細胞周期作用的適宜濃度和處理時間,最后初步探討EPO影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞增殖、凋亡的作用機制。主要方法:1.依據(jù)前人的方法從成年大鼠脊髓中央管膜下提取出神經(jīng)干細胞,并利用細胞免疫熒光染色進行鑒定。2.用CCK8檢測初步篩選EPO影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞的適宜濃度和處理時間,并通過神經(jīng)球計算、細胞計數(shù)對適宜濃度和處理時間進行佐證。3.繼續(xù)利用EdU檢測、TUNEL檢測及流式細胞周期驗證適宜濃度EPO在適宜處理時間影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡及細胞周期的影響,最后通過熒光定量PCR檢測相關(guān)基因表達的變化。4.采用SPSS20.0軟件(IBM公司)對數(shù)據(jù)進行處理,實驗結(jié)果計量以均數(shù)±標準差(X ±SD)或均數(shù)X表示。組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),若方差齊用LSD檢驗、方差不齊則用Dunnett T3檢驗作兩兩比較,當(dāng)P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:本實驗成功從成年大鼠脊髓中央管膜下提取出神經(jīng)干細胞,CCK8檢測篩選出5U/ml、20U/ml濃度的EPO可能為影響成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞增殖的適宜濃度,而適宜的處理時間可能為96h。隨后,通過神經(jīng)球計算、細胞計數(shù)、EdU檢測、流式細胞周期檢測的結(jié)果也進一步驗證了 CCK8結(jié)果;TUNEL檢測也證實了適宜濃度及處理時間的EPO可以下調(diào)神經(jīng)干細胞的細胞凋亡。最后,PCR檢測結(jié)果也證明了適宜濃度及處理時間的EPO可以上調(diào)抗凋亡、細胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因。結(jié)論:5U/ml、20U/ml濃度的EPO可能為體外促進成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞增殖、抗凋亡、細胞周期調(diào)節(jié)的適宜濃度,而適宜的處理時間可能為96h。
【圖文】：

碩士學(xué)位論文逡逑球（圖２Ａ）。原代神經(jīng)干細胞傳代后培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)１周，神經(jīng)干細胞可聚逡逑集形成規(guī)則圓形、直徑約為ｌＯＯｕｍ的神經(jīng)球（圖２Ｂ）。逡逑圖２．倒置相差顯微鏡下觀察成年大鼠脊髓神經(jīng)干細胞生長情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｄｕｌｔ邋ｒａｔ邋ｓｐｉｎａｌ邋ｃｏｒｄ邋ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ逡逑圖Ａ示原代成年大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞培養(yǎng)一周后形成大小不一神經(jīng)球；圖Ｂ示逡逑原代神經(jīng)干細胞傳代后培養(yǎng)一周形成規(guī)則圓形、直徑約為ｌＯＯｕｍ的神經(jīng)球。逡逑Ａ．Ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｄｅｒｉｖｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ａｄｕｌｔ邋ｒａｔ邋ｓｐｉｎａｌ邋ｃｏｒｄ邋ｃａｎ邋ｆｏｒｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｉｚｅｓ邋ｏｆ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ逡逑ａｆｔｅｒ邋ａ邋ｗｅｅｋ邋ｏｆ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ；邋Ｂ．Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｎｅｕｒａｌ邋ｓｔｅｍ邋ｃｅｌｌｓ邋ｃｏｕｌｄ邋ｆｏｒｍ邋ａ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｇｕｌａｒ逡逑ｃｉｒｃｌｅ邋ａｎｄ邋ａ邋ｄｉａｍｅｔｅｒ邋ａｂｏｕｔ邋ｌＯＯｕｍ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｆｏｒ邋ａ邋ｗｅｅｋ．逡逑１．２．３免疫熒光染色鑒定結(jié)果逡逑體外培養(yǎng)的成年ＳＤ大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞行Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２免疫逡逑熒光染色，，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞可以穩(wěn)定表達神經(jīng)前體細胞標志蛋白Ｎｅｓｔｉｎ逡逑（圖３Ａ）及干細胞轉(zhuǎn)錄因子Ｓｏｘ２邋（圖３Ｂ）。免疫熒光染色同時，用Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑進行核染色標記（圖３Ｃ）。拍照后將Ｎｅｓｔｉｎ

體外培養(yǎng)的成年ＳＤ大鼠脊髓中央管膜下神經(jīng)干細胞行Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２免疫逡逑熒光染色，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞可以穩(wěn)定表達神經(jīng)前體細胞標志蛋白Ｎｅｓｔｉｎ逡逑（圖３Ａ）及干細胞轉(zhuǎn)錄因子Ｓｏｘ２邋（圖３Ｂ）。免疫熒光染色同時，用Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑進行核染色標記（圖３Ｃ）。拍照后將Ｎｅｓｔｉｎ和Ｓｏｘ２邋（圖３Ｄ）、Ｎｅｓｔｉｎ和Ｈｏｅｃｈｓｔ逡逑（圖３Ｅ）的圖片進行融合。逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R651.2

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本文編號：2656929