【摘要】：研究目的:褪黑素是一種主要由松果體合成的激素,與骨科疾病如特發(fā)性脊柱側(cè)凸(idiopathic scoliosis,IS)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。現(xiàn)有的研究尚不能明確地闡明褪黑素分泌量和節(jié)律性與特發(fā)性脊柱側(cè)凸和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,及補(bǔ)充褪黑素是否能阻止上述疾病的發(fā)展。我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞具有雙重效應(yīng),并存在濃度依賴性,低濃度褪黑素促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,而高濃度褪黑素抑制成骨細(xì)胞增殖。經(jīng)過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:低濃度褪黑素作用于成骨細(xì)胞褪黑素受體,與G蛋白結(jié)合,激活I(lǐng)P3,引起Ca~(2+)濃度上升,通過(guò)調(diào)節(jié)CaMKs/MEK/ERK通路,促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖;隨著褪黑素濃度的增加,達(dá)到較高濃度時(shí),上述機(jī)制被抑制,激活細(xì)胞膜鈣離子通道,細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)失調(diào),引起鈣超載,進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞增殖。我們前期也證實(shí)高濃度褪黑素可以引起鈣超載,抑制成骨細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡。本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上,全面深入探討褪黑素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制,闡明褪黑素通過(guò)Septin7誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞自噬和凋亡的相關(guān)性,為褪黑素治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸提供理論依據(jù)及新的思路。研究方法:1、MTT檢測(cè)褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響;2、Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞凋亡率;3、Hoechst33342染色檢測(cè)褪黑素對(duì)細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集的影響;4、MDC染色觀察褪黑素對(duì)成骨細(xì)胞自噬的影響;5、應(yīng)用Septin7 siRNA沉默Septin7表達(dá),證實(shí)褪黑素作用于Septin7引起成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;6、SEPT 7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染到Septin7 siRNA穩(wěn)定的成骨細(xì)胞中,進(jìn)一步證實(shí)褪黑素作用于Septin7引起成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激7、應(yīng)用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4PBA、自噬抑制劑3MA,闡明褪黑素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞自噬和凋亡的相關(guān)性,研究結(jié)果:1、高濃度褪黑素抑制成骨細(xì)胞增殖MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度褪黑素(1、2、4、8mmol/L)作用成骨細(xì)胞24h、48h、72h后,細(xì)胞增殖率均有下降,其中較高濃度(2、4、8mmol/L)作用6h后,細(xì)胞增殖率也有下降,且與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中褪黑素濃度為2mmol/L作用時(shí)間為24h時(shí),細(xì)胞增殖率明顯下降。2、高濃度褪黑素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色流式細(xì)胞術(shù)顯示,當(dāng)褪黑素作用成骨細(xì)胞24h,濃度達(dá)到2mmol/L時(shí),成骨細(xì)胞早期及晚期凋亡明顯增加,并隨褪黑素濃度增大而增加,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。單獨(dú)應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4PBA及自噬抑制劑3MA對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響,當(dāng)聯(lián)合高濃度褪黑素作用于成骨細(xì)胞時(shí),其誘導(dǎo)的凋亡程度明顯增強(qiáng)。3、高濃度褪黑素引起成骨細(xì)胞核內(nèi)致密濃染,產(chǎn)生凋亡小體Hoechst33342熒光染色結(jié)果顯示,當(dāng)1mM褪黑素作用成骨細(xì)胞24h,細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染,濃度達(dá)2mM及以上時(shí),細(xì)胞形態(tài)上可見部分細(xì)胞呈碎塊狀致密濃染,并產(chǎn)生凋亡小體,細(xì)胞凋亡明顯。4、高濃度褪黑素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞自噬單丹磺酰尸胺MDC染色結(jié)果顯示,2mM褪黑素作用成骨細(xì)胞24h,細(xì)胞內(nèi)可見熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)的自噬小體。5、褪黑素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬和凋亡的相關(guān)性Western blot結(jié)果顯示,2mM褪黑素作用成骨細(xì)胞24h、48h,可以引起凋亡標(biāo)志蛋白PARP-1的切割。同時(shí)發(fā)現(xiàn)2mM褪黑素作用成骨細(xì)胞6h、24h、48h,均可以引起自噬標(biāo)志性蛋白LC3-II的表達(dá)上調(diào)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)增加。單獨(dú)應(yīng)用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4PBA時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白PARP-1無(wú)明顯影響,當(dāng)4PBA及自噬抑制劑3MA聯(lián)合高濃度褪黑素作用于成骨細(xì)胞時(shí),可以增加其誘導(dǎo)的凋亡程度。6、Septin7與褪黑素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性為更好地了解褪黑素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞septin7與褪黑素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系,septin7 siRNA干擾septin7的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染siRNA septin7成骨細(xì)胞可顯著降低GRP 78和CHOP的表達(dá),即使與褪黑素聯(lián)合使用,變化也不顯著,證實(shí)褪黑素介導(dǎo)的ER應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖是通過(guò)作用于septin7的表達(dá)。我們還研究了外源表達(dá)的septin7是否能逆轉(zhuǎn)septin7基因敲除引起的GRP 78的抑制和CHOP的表達(dá),通過(guò)septin7過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染siRNA septin7成骨細(xì)胞,Westernblot檢測(cè)7、GRP78和CHOP蛋白水平。如圖8A,B所示,在褪黑素誘導(dǎo)的siRNA septin7成骨細(xì)胞中,外源性septin7恢復(fù)了septin7的表達(dá),我們還發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞的GRP 78和CHOP表達(dá)明顯高于對(duì)照組,但是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是septin7的表達(dá)并沒(méi)有改變。研究結(jié)論1、高濃度褪黑素作用于成骨細(xì)胞,抑制成骨細(xì)胞增殖,引起成骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,引起成骨細(xì)胞發(fā)生自噬,誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬出現(xiàn)在高濃度褪黑素作用的早期,二者共同起到保護(hù)細(xì)胞的促存活作用,后期過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起自噬性凋亡誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,而septin7是褪黑素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的靶蛋白。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 高濃度褪黑素抑制成骨細(xì)胞增殖人成骨細(xì)胞系 hFOB1.19 是一種非常好的細(xì)胞增殖研究模型。我們的前期實(shí)實(shí)，低濃度褪黑素可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。為了研究高濃度褪黑素對(duì)成骨細(xì)殖的影響，我們進(jìn)行了 MTT 實(shí)驗(yàn)。如圖 1 所示，MTT 結(jié)果表明：高濃度褪黑素(1、2、4、8mmol/L)作用成骨細(xì)h、48h、72h 后，細(xì)胞增殖率均有下降，其中較高濃度(2、4、8mmol/L)作用，細(xì)胞增殖率也有下降，且與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，其中褪濃度為 2mmol/L 作用時(shí)間為 24h 時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯下降。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.2 高濃度褪黑素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡如圖 2 所示 Annexin V-FITC/PI 雙標(biāo)染色流式細(xì)胞術(shù)顯示，當(dāng)褪黑素作用成骨細(xì)胞 24h，濃度達(dá)到 2mmol/L 及 2mmol/L 以上時(shí)，成骨細(xì)胞早期及晚期凋亡明顯增加，并隨褪黑素濃度增大而增加，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R682.3

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本文編號(hào)：2639894