【摘要】：骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是目前全球范圍中老年人最常見的骨關(guān)節(jié)退行性疾病,也是引發(fā)關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)功能喪失甚至導(dǎo)致殘疾的最常見骨關(guān)節(jié)疾病。流行病學(xué)調(diào)查表明,40歲以上人群原發(fā)性O(shè)A的總患病率為46.3%,且呈現(xiàn)隨年齡增長而增高的趨勢。目前臨床上治療OA的保守方法和效果有限,最終還是需要進行關(guān)節(jié)置換手術(shù)。然而手術(shù)帶來的并發(fā)癥對患者來說都是災(zāi)難性的后果。OA的治療及疾病發(fā)展所致的殘疾都給家庭和社會帶來極大的經(jīng)濟負擔(dān)。因此,探索關(guān)節(jié)軟骨退行性變的有效防治措施、阻斷OA發(fā)生進程是臨床亟需解決的熱點問題。在OA的進展過程中,以軟骨下骨的病變最先開始出現(xiàn),主要表現(xiàn)為骨質(zhì)重塑增加、軟骨下骨硬化、軟骨下骨板變厚、骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞以及骨質(zhì)的流失。軟骨下骨的病變繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的一些變化,包括軟骨細胞增生、基質(zhì)降解蛋白酶的合成增多、軟骨細胞表型缺失、關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄等等。作為力學(xué)支持結(jié)構(gòu),軟骨下骨的硬化也導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨就吸收更多的應(yīng)力,導(dǎo)致軟骨表型改變,基質(zhì)降解,軟骨退變的發(fā)生。也有研究認為,OA的發(fā)展過程中盡管軟骨下骨的骨重建增強,但因骨重建增加所致的局部礦化不足,引起軟骨下骨的彈性系數(shù)降低,導(dǎo)致其上方的關(guān)節(jié)軟骨在機械力或負荷作用下變形甚至開裂。異常的力學(xué)作用如何導(dǎo)致軟骨下骨重塑的改變,以及如何進一步導(dǎo)致軟骨退變,目前尚無定論。高強度運動,比如馬拉松、過度負重等競技項目,是否會對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生不可逆的破壞,至今尚無定論。雖然流行病學(xué)統(tǒng)計調(diào)查發(fā)現(xiàn)長跑運動員中OA的患病率與正常人的群體并無統(tǒng)計學(xué)差別,但是,許多動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)長跑運動員的膝關(guān)節(jié)會出現(xiàn)MRI(magnetic resonance imaging)可檢測的,且與持續(xù)性膝關(guān)節(jié)疼痛有關(guān)的病變。另外,大量的動物實驗也證明,不僅是高強度的跑步運動,其他一些被動的重復(fù)執(zhí)行的運動,也可以導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨骨質(zhì)代謝改變、關(guān)節(jié)軟骨的破壞,誘導(dǎo)OA的發(fā)生。因此,為了探討過度運動是否會對膝關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生損傷,并深入研究其相關(guān)的軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨的反應(yīng)機制,我們進行了本次研究。我們將研究分成三部分,第一部分:明確高強度運動是否會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨重塑改變和軟骨退變;第二部分:探索在高強度運動的條件下,骨祖細胞定向募集異常導(dǎo)致軟骨下骨重塑增加的機制;第三部分:研究骨-軟骨復(fù)合體之間的物質(zhì)運輸異常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變的機制。第一部分高強度運動導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨重塑改變和軟骨退變[背景]在類似于馬拉松的競技運動中,長期高強度跑步運動是否會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)損傷目前仍存在有爭議。[目的]為了明確高強度跑步運動對于膝關(guān)節(jié)軟骨下骨和關(guān)節(jié)軟骨的影響。[方法和結(jié)果]將C57BL/6小鼠分成3個組,為對照組、中等強度組和高強度組,分別進行不同強度的跑步運動,4周后進行膝關(guān)節(jié)MRI檢查,在T2加權(quán)脂肪抑制序列上觀察軟骨下骨內(nèi)信號,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著運動強度的增加,脛骨和股骨髁髓腔內(nèi)的信號都逐漸上升,統(tǒng)計量化指標(biāo)顯示,高強度組的相對信號值明顯高于對照組(P=0.017和P=0.024)。在第5周處死小鼠,對小鼠的膝關(guān)節(jié)進行Micro-CT掃描,分析計算軟骨下骨的形態(tài)學(xué)參數(shù),發(fā)現(xiàn)顯示小鼠脛骨軟骨下骨骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)(P=0.031 和P=0.0034)和骨小梁數(shù)量(trabecular number,Tb.N)明顯高于對照組和中等強度組(P值均0.001);骨小梁間隙(trabecular space,Tb.Sp)明顯低于對照組和中等強度組(P均0.001)。對小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本進行番紅-固綠染色、HE染色,結(jié)果提示:高強度運動組的膝關(guān)節(jié)軟骨面不平整,黏多糖染色出現(xiàn)局部丟失,高強度組鈣化軟骨層內(nèi)的肥大軟骨細胞數(shù)量明顯高于對照組(P=0.025),同時鈣化軟骨層體積(P0.001)和厚度(P=0.005)均高于對照組。不僅在鈣化軟骨層參數(shù)出現(xiàn)變化,高強度組的軟骨下骨板厚度較對照組(P0.001)和中等強度組(P=0.009)均明顯升高。[結(jié)論]高強度運動可導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨下骨內(nèi)骨髓損傷,并且軟骨下骨骨小梁出現(xiàn)重塑異常和軟骨表征的改變。需要進一步研究高強度運動導(dǎo)致這些改變的具體機制。第二部分骨祖細胞募集異常導(dǎo)致軟骨下骨重塑失衡的機制研究[背景]我們在第一部分的研究中發(fā)現(xiàn)了高強度運動可導(dǎo)致軟骨下骨骨小梁骨重塑異常,而目前關(guān)于此現(xiàn)象的具體機制尚無定論;相關(guān)研究認為骨祖細胞的募集對于骨形成具有重要作用,據(jù)此我們提出假說,高強度運動所致的骨重塑增加與骨髓腔內(nèi)骨祖細胞的異常募集有關(guān)。[目的]進一步研究軟骨下骨髓腔內(nèi)骨祖細胞的異常募集在軟骨下骨骨質(zhì)重塑失衡的作用機制。[方法和結(jié)果]三維重建膝關(guān)節(jié)的CT數(shù)據(jù),高強度運動組的骨體積/組織體積(BV/TV)較對照組(P=0.0048)和中等強度(P=0.015)組明顯增高(A,B)。用第一部分所獲得的標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)和Goldner三色染色,結(jié)果顯示強度組軟骨下骨內(nèi)膜表面的OCN表達明顯上升(P0.001),脛骨軟骨下骨成骨活性明顯高于其余兩組,但出現(xiàn)大片的類骨質(zhì)和未礦化骨,同時破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色結(jié)果提示軟骨下骨內(nèi)破骨細胞活性組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.21)。為了明確骨祖細胞在髓腔內(nèi)的分布,在跑步5周后對膝關(guān)節(jié)軟骨下骨髓腔內(nèi)的細胞進行流式細胞檢測,發(fā)現(xiàn)過度運動后小鼠軟骨下骨表面的骨祖細胞(endosteal mesenchymal progenitor,EMP)占總細胞的百分比數(shù)較對照組明顯增加(P=0.034),細胞集落培養(yǎng)(CFU)的結(jié)果也表明高強度運動組的骨祖細胞集落數(shù)相對值較對照組(P=0.028)和中等強度組(P=0.037)增多,但髓腔內(nèi)間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的集落數(shù)較中等強度組(P=0.0048)和對照組明顯減少(P=0.044)。為了體外模擬高強度應(yīng)力對細胞的作用,提取膝關(guān)節(jié)軟骨下骨髓腔內(nèi)的骨祖細胞培養(yǎng),用細胞牽拉器予貼壁細胞不同強度的應(yīng)力刺激,分別是0%應(yīng)變0 Hz頻率(對照)、5%應(yīng)變0.5 Hz頻率(5%,0.5 Hz),20%應(yīng)變1 Hz頻率(20%,1 Hz),通過劃痕實驗我們發(fā)現(xiàn)骨祖細胞的遷移能力隨應(yīng)力刺激強度的增加而下降。為了明確骨祖細胞的遷移和募集異常是否與初級纖毛的形成和功能障礙有關(guān),我們運用流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)高強度應(yīng)力作用明顯抑制了組裝初級纖毛的重要成分——α-Tubulin在骨祖細胞中的表達。并且,α-Tubulin合成的驅(qū)動因子KIF3A在軟骨下骨內(nèi)的基因表達也出現(xiàn)下調(diào)(P=0.0029)。進一步利用免疫印跡(western blot)檢測發(fā)現(xiàn)與KIF3A合成相關(guān)的激動因子PKA-C在高強度應(yīng)力刺激后表達下調(diào)。利用免疫定量檢測試劑盒和實時定量聚合連反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)實驗發(fā)現(xiàn),高強度運動明顯抑制軟骨下骨內(nèi)cAMP和AC6的表達(P均0.05)。[結(jié)論]高強度運動刺激軟骨下骨內(nèi)的AC6表達受抑制,從而抑制cAMP/PKA/KIF3A信號通路,導(dǎo)致α-Tubulin合成下降,骨祖細胞初級纖毛組裝和功能受損,出現(xiàn)過度募集于軟骨下骨,促使軟骨下骨質(zhì)重塑。第三部分 高強度運動通過抑制軟骨下骨PDGF-AA生成導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變機制研究[背景]在第一部分的研究中證實了高強度運動可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變,同時很多研究認為骨-軟骨復(fù)合體之間的物質(zhì)傳輸在關(guān)節(jié)軟骨退變中具有重要作用。血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)-AA是促進細胞存活,調(diào)控細胞分化的重要因子,而PDGF/Akt在骨-軟骨復(fù)合體中的作用目前尚無相關(guān)報道。[目的]明確在高強度運動作用下軟骨下骨代謝變化如何導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨終末分化以及軟骨退變。[方法和結(jié)果]為了明確高強度運動后關(guān)節(jié)軟骨的表型特征,利用免疫組化檢測COL10和MMP13在關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的表達水平,結(jié)果顯示高強度運動組的鈣化軟骨層內(nèi)COL10和MMP13陽性細胞數(shù)均高于對照組(P均0.001)和中等強度組(P=0.0052和0.001),同時TUNEL試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)高強度組的凋亡細胞數(shù)量較對照組(P=0.002)和中等強度組(P=0.007)明顯增多。提取小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨下骨的mRNA進行RT-PCR,發(fā)現(xiàn)高強度運動可明顯抑制軟骨下骨內(nèi)Pdgfa的表達(P均0.01),該結(jié)果在免疫組化實驗中也得到驗證。為了進一步明確是否高強度應(yīng)力刺激抑制了軟骨下骨內(nèi)的成骨細胞合成PDGF-AA,從而導(dǎo)致了上層軟骨的病變,體外培養(yǎng)MC3T3前成骨細胞并進行不同強度的應(yīng)力刺激,以模擬軟骨下骨的應(yīng)力環(huán)境。隨著應(yīng)力刺激強度的增加,PDGF-AA的基因和蛋白表達水平下降(P均0.05);同時收集刺激后的條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)軟骨細胞(mechanical treatment,MT),培養(yǎng) 3 天后細胞 Mmp13、Col10a1 的表達上調(diào)(P均0.05),而條件培養(yǎng)基中加入10ng/mL PDGF-AA(MT+PDGF)后共培養(yǎng)可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象(P均0.05)。共培養(yǎng)后細胞凋亡染色顯示類似結(jié)果:MT+PDGF可明顯抑制MT共培養(yǎng)導(dǎo)致的軟骨細胞死亡(P均0.05),說明PDGF-AA合成減少導(dǎo)致了軟骨細胞的終末分化和凋亡。繼續(xù)深入研究發(fā)現(xiàn),高強度運動不僅抑制軟骨下骨PDGF-AA的表達,關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)p-Akt的活性也受到抑制(P=0.018),體外實驗同樣證實,軟骨細胞經(jīng)MT條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后,Akt的磷酸化水平下降,而加入PDGF-AA后得到磷酸化水平恢復(fù)。[結(jié)論]在高強度運動狀態(tài)下,從軟骨下骨內(nèi)向關(guān)節(jié)軟骨定向運輸?shù)腜DGF-AA和關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)PDGF/Akt信號通路的活性受到抑制,而這些對于關(guān)節(jié)軟骨表型的保持,延緩軟骨細胞終末分化和凋亡具有重要的作用。
【圖文】：

包括軟骨細胞增生、軟骨基質(zhì)合成、軟骨細胞中促炎因子（包括白細胞介素－１，逡逑ＩＬ－１）的產(chǎn)生增多、一些酶類，如基質(zhì)降解蛋白酶的合成增多、軟骨細胞表型缺逡逑失、關(guān)節(jié)軟骨厚度變薄等等（圖１）邋［１２］。軟骨下骨的硬化也導(dǎo)致了其作為支持結(jié)逡逑構(gòu)來吸收力學(xué)作用的能力下降，因此關(guān)節(jié)軟骨就吸收了更多的應(yīng)力和應(yīng)變，導(dǎo)逡逑致軟骨表型改變，基質(zhì)降解，軟骨退變的發(fā)生［１４］。也有研宄認為，０Ａ的發(fā)展過逡逑程中膝關(guān)節(jié)髁內(nèi)的骨小梁厚度增加、骨小梁間隙變窄并出現(xiàn)骨基質(zhì)礦化減少，逡逑導(dǎo)致骨硬度降低，，且以退化的關(guān)節(jié)軟骨下方的軟骨下骨病變最顯著［１５］。盡管軟逡逑骨下骨的骨重建增強，但因骨重建增加所致的局部礦化不足，引起軟骨下骨的逡逑彈性系數(shù)降低，導(dǎo)致其上方的關(guān)節(jié)軟骨在機械力或負荷作用下變形甚至開裂［１６］。逡逑因此，０Ａ發(fā)生中軟骨的退行性改變主要繼發(fā)于軟骨下骨的病變［１７］。逡逑軟骨下骨骨質(zhì)合成代謝由成骨細胞的成骨作用與破骨細胞的骨吸收作用共逡逑同協(xié)調(diào)作用下完成的

為了進一步觀察高強度運動對關(guān)節(jié)軟骨表型的影響，我們進行ＨＥ染色和番逡逑紅－固綠染色。番紅－固綠染色結(jié)果提示：高強度運動組的膝關(guān)節(jié)軟骨面不平整，逡逑黏多糖染色出現(xiàn)局部丟失，并且表層軟骨出現(xiàn)部分裂隙（圖１－２邋Ａ）。計算鈣化逡逑軟骨層內(nèi)的肥大軟骨細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)高強度組的肥大軟骨細胞數(shù)量高于對照組逡逑（２２４．１０±９０．０８邋個／ｍｍ２ｖｓ７９．２６土３６．４１邋個／ｍｍ２，邋Ｎ＝６／組，Ｐ＝０．０２５）（圖邋１－２邋Ａ，逡逑Ｃ）。番紅－固綠染色和ＨＥ結(jié)果均提示，高強度運動后，小鼠膝關(guān)節(jié)的鈣化軟骨逡逑層厚度較對照組明顯升高（４２．６８±４．８６ｎｍｖｓ３５．８４±４．６３｜ｉｍ，邋Ｎ＝１０，邋／ＭＸＯＯＳ）逡逑（圖１－２邋Ｂ，邋Ｃ）；同時，高強度組的鈣化軟骨層體積也明顯高于對照組（６００７７．６２逡逑±６１９６．３３邋ｐｍ２ｖｓ邋４８３５２．１８±２８９７．４８邋ｐｍ２，邋Ｎ＝１０８／組，ＰＯ．ＯＯｌ）和中等強度組逡逑（６００７７＿６２±６１９６．３３邋（ａｍ邋ｖｓ邋５２４６６．４１邋±５４５３．１５邋｜ｉｍ２，邋Ｎ＝１０，邋Ｐ＝０．００２）（圖邋１－２邋Ｂ，逡逑Ｃ）。不僅是鈣化軟骨層參數(shù)出現(xiàn)變化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R687.4

【參考文獻】

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1 薛慶云;王坤正;裴福興;朱漢民;金大地;陶天遵;李恩;李寧華;張耀南;王曉濱;紀泉;;中國40歲以上人群原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎患病狀況調(diào)查[J];中華骨科雜志;2015年12期

本文編號：2618899