【摘要】：孕期及出生后早期動物暴露于全身麻醉藥(GA)導致發(fā)育期腦神經毒性。迄今,臨床上未出現(xiàn)比GA更安全有效的替代藥物。因此,如何修復GA介導發(fā)育期腦神經毒性是一個迫在眉睫的問題。在腦損傷時,靜止期腦神經干細胞(NSC)重新被激活,增殖、分化產生新生神經元修復受損腦區(qū)。NSC增殖是內源性修復的關鍵始動環(huán)節(jié)。研究GA調節(jié)NSC增殖作用對修復GA介導的腦神經毒性具有重要的臨床意義。在小鼠大腦室管膜下區(qū)、嗅球及齒狀回發(fā)現(xiàn)大量與神經細胞類型、發(fā)育進程、人類疾病相關的特異性長鏈非編碼RNA(lncRNA)。研究表明lncRNA作為競爭性RNA調節(jié)靈長類NSC增殖。究竟哪些lncRNA參與調控GA對NSC增殖作用及如何調控?仍一無所知。第一章適宜基因芯片檢測的七氟醚暴露NSC模型構建目的:構建適宜基因芯片檢測lncRNA表達譜的七氟醚暴露NSC模型。方法:新生大鼠海馬來源的NSC原代培養(yǎng)后暴露于七氟醚和對照氣體0、3、6、12h,CCK-8檢測NSC增殖能力,流式細胞儀檢測NSC存活率,瓊脂糖電泳和分光光度計檢測細胞樣品質量。結果:與對照組比較,七氟醚呈暴露濃度和時間依賴性抑制離體培養(yǎng)NSC增殖和存活,2.4%七氟醚暴露6 hNSC細胞樣品質量符合基因芯片檢測質控要求。結論:暴露于2.4%七氟醚6 h離體培養(yǎng)NSC適宜于基因芯片檢測。第二章七氟醚暴露NSC中l(wèi)ncRNA表達譜研究目的:研究七氟醚暴露后NSC中l(wèi)ncRNA差異性表達譜,篩選與NSC增殖相關的目標lncRNA。方法:采用lncRNA基因芯片檢測七氟醚暴露NSC中l(wèi)ncRNA表達譜,qPCR驗證隨機挑選的10個lncRNA和10個mRNA表達水平,經生物信息學分析,篩選并驗證MRAK080926和MRAK157758及其鄰近基因。結果:qPCR結果與基因芯片表達譜一致,Wnt5a和Gadd45a與NSC增殖相關,上調表達的MRAK080926和MRAK157758分別與鄰近基因Wnt5a和Gadd45a呈正相關。結論:MRAK080926和MRAK157758與七氟醚對NSC增殖作用相關。第三章MRAK080926調控七氟醚對NSC增殖作用目的:探討MRAK080926調控七氟醚對NSC增殖影響,初步研究其調控途徑。方法:沉默MRAK080926后采用細胞克隆平板實驗、CCK-8及EDU實驗檢測七氟醚暴露的NSC增殖能力,流式細胞儀和Tunel實驗檢測NSC存活率,流式細胞儀檢測細胞周期和ROS水平,qPCR檢測MRAK080926和Wnt5a mRNA表達,Western blot檢測Wnt5a、RYK及BAX蛋白表達。結果:沉默MRAK080926后促進七氟醚暴露的NSC增殖,MRAK080926表達和Wnt5a/RYK-ROS信號軸活性也隨之下調,促進G0期NSC進入細胞周期,S期延長。結論:沉默MRAK080926挽救七氟醚暴露NSC增殖作用,與抑制Wnt5a/RYK-ROS信號軸和促進NSC再次進入細胞周期相關。總結:七氟醚抑制NSC增殖,lncRNA表達譜存在明顯差異,MRAK080926表達明顯上調,沉默MRAK080926后抑制Wnt5a/RYK-ROS信號軸,促進NSC增殖。
【圖文】：

圖１－１原代ＮＳＣ免疫熒光圖像逡逑采用巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）作為ＮＳＣ標記（紅色），ＧＦＡＰ邋（紅色）作為星形膠質細胞標、Ｎ（紅色）作為神經元標記物染色的ＮＳＣｓ的免疫熒光圖像，使用４’６－二脒基－２－苯基吲（ＤＡＰＩ）（藍色）對核進行復染色。標尺：ｌＯＯｐｍ逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣ邋ｉｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ．逡逑Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ＮＳＣ邋ａｔ邋ｐａｓｓａｇｅ邋３邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａｎｔｉ－ｎｅｓｔｉｎ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋（ｒｅｄ）邋ａｓ邋ａＮＳＣ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ＧＦＡＰ邋（ｒｅｄ），邋ａｓ邋ａｎ邋ａｓｔｒｏｃｙｔｅ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ｏｒ邋ＮＳＥ邋（ｒｅｄ），邋ａｓ邋ａ邋ｎｅｕｒｏｎａｌ邋ｍａｒｋｅｒ，邋ｗｉｔｈ逡逑ｎｕｃｌｅｉ邋ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｅｄ邋ｕｓｉｎｇ邋４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ邋（ＤＡＰ１）邋（ｂｌｕｅ）．邋Ｂａｒ：邋１００邋ｊａｍ．逡逑２七氟醚抑制ＮＳＣ增殖逡逑為了探討七氟醚暴露濃度和時間誘導ＮＳＣ增殖變化的趨勢，我們采用胞毒性較低的ＣＣＫ－８實驗檢測細胞ＯＤ４５0ｎｍ，通過細胞活性間接反映Ｎ殖情況。不同濃度的七氟醚或不同暴露時間對細胞增殖影響不同，差異具

逑無此效應。由此可見，七氟醚呈暴露濃度和暴露時間依賴性介導ＮＳＣ增殖受逡逑抑制（圖１－２）。逡逑＾邐－ａ－邋ＮＳＣｓ＋１，２％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑Ｉ１１０］邐ＮＳＣｓ＋２．４％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑！邋１００－邐．邐ＮＳＣｓ＋３．６％ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ逡逑ｉ邋８。逡逑Ｉ７０－逡逑＝ｓ邋６０－Ｉ邐．邐．邐．逡逑ｕ邋０邐５邐１０邐１５逡逑ｄｕｒａｔｉｏｎ逡逑圖１－２邋ＣＣＫ８檢測不同濃度七氟醚暴露不同時間對ＮＳＣ增殖的影響逡逑＊表示與對照組相比：戶＜0．0５；邐＃表示與暴露６ｈ相比：尸＜０．０５逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｉｍｅ－ｍａｎｎｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ逡逑ａｎｄ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ＮＳＣ．逡逑＊：ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，尸＜０．０５．邋＃：邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｓｅｖｏｆｌｕｒａｎｅ邋ｅｘｐｏｓｕｒｅ邋ｆｏｒ邋６邋ｈ逡逑２．３七氟醚暴露后ＮＳＣ存活逡逑為建立適宜基因芯片檢測的ＮＳＣ模型，篩選七氟醚暴露濃度和時間。結合逡逑ＣＣＫ－８實驗結果和文獻報道［５］，選擇１邋ＭＡＣ邋（２．４％）七氟醚探討不同暴露時間逡逑對ＮＳＣ存活的影響。２．４％七氟醚抑制ＮＳＣ存活，不同暴露時間抑制ＮＳＣ存活逡逑率差異具有統(tǒng)計學意義0Ｐ＝0．000），隨著七氟醚暴露時間延長，細胞凋亡和壞死逡逑逐漸增多
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R614

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