【摘要】：背景:蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)是臨床常見(jiàn)的腦血管危急重癥,占據(jù)了所有卒中的5%左右。SAH患者具有致死率高、致殘率高的特點(diǎn),因而,SAH的治療干預(yù)仍然是神經(jīng)科醫(yī)師面臨的重大挑戰(zhàn)。早期腦損傷(EBI)是指蛛網(wǎng)膜下腔出血開(kāi)始至72小時(shí)這一時(shí)間窗的腦損傷。近來(lái)研究認(rèn)為EBI可能是SAH后致死致殘的主要原因。EBI涉及一系列病理生理過(guò)程,包括腦灌注壓下降、血腦屏障破壞、腦腫脹和神經(jīng)元凋亡等。大量研究表明,SAH后EBI和神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞,其活化可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的釋放。因此,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、減少神經(jīng)炎癥成為治療蛛網(wǎng)膜下腔出血有前景的策略。Toll樣受體4(TLR4)是發(fā)現(xiàn)最早的TLRs亞型之一,其介導(dǎo)的炎癥調(diào)節(jié)信號(hào)通路在SAH后早期腦損傷中發(fā)揮重要作用。尤其是,TLR4在小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)了SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞活化,激活了炎癥信號(hào)通路,促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。TLR4通過(guò)依賴(lài)My D88途徑激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)炎癥因子合成。這些研究提示,TLR4信號(hào)通路是治療蛛網(wǎng)膜下腔出血的一個(gè)有效的靶點(diǎn)。Peli1是一E3泛素化連接酶,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)。Peli1激活后,可介導(dǎo)TLR4誘導(dǎo)的炎癥因子在小膠質(zhì)細(xì)胞合成。Peli1通過(guò)細(xì)胞凋亡抑制蛋白(c IAP)的K63泛素化,介導(dǎo)My D88依賴(lài)的MAPK信號(hào)通路激活。這些研究提示了Peli1在神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)中的潛在作用。目的:探討Peli1在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷中的作用,同時(shí)研究Peli1與TLR4信號(hào)通路對(duì)早期腦損傷中小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)機(jī)制及兩者相互作用關(guān)系。方法:第一部分1、通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈線(xiàn)栓刺破法建立C57小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型,通過(guò)Western blot和免疫熒光檢測(cè)Peli1蛋白在小鼠腦組織和小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2中的時(shí)空性表達(dá)。2、通過(guò)Western blot檢測(cè)SAH后6 h、24 h、48 h和72 h不同時(shí)間點(diǎn)TLR4、c IAP1/2以及MAPK家族蛋白(p-JNK和p-ERK)的表達(dá)。第二部分1、構(gòu)建Peli1慢病毒干擾載體,轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞后,通過(guò)q RT-PCR檢測(cè)Peli1基因并驗(yàn)證其干擾效率。2、經(jīng)C57小鼠側(cè)腦室注射Peli1慢病毒干擾載體上清和無(wú)義序列慢病毒上清,將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+無(wú)義序列組(SAH+Peli1-NC)和蛛網(wǎng)膜下腔出血+干擾組(SAH+Peli1-KD),通過(guò)Garcia評(píng)分檢測(cè)SAH造模后48小時(shí)三組間神經(jīng)功能缺陷程度,通過(guò)MRI掃描檢測(cè)腦組織水腫情況,通過(guò)Western blot檢測(cè)TLR4、My D88、c IAP1/2、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl2和Bax)、MAPK家族蛋白(p-JNK和p-ERK)以及i NOS蛋白的表達(dá),通過(guò)ELISA檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)。第三部分1、通過(guò)免疫熒光觀察SAH后TLR4和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記IBA1的表達(dá)情況;2、C57小鼠尾靜脈注射TLR4抑制劑TAK242;C57小鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血+溶劑對(duì)照組(SAH+vehicle組)和蛛網(wǎng)膜下腔出血+TAK242組(SAH+TAK242組),通過(guò)Garcia評(píng)分檢測(cè)SAH造模后48小時(shí)三組間神經(jīng)功能缺陷程度,通過(guò)Western blot檢測(cè)三組間TLR4、My D88、i NOS、Peli1、c IAP1/2以及凋亡相關(guān)蛋白(Bcl2和Bax)、MAPK家族蛋白(p-JNK和p-ERK)的表達(dá)。結(jié)果:第一部分1、在實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中,Peli1蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性增高。2、Peli1蛋白主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較低。3、蛛網(wǎng)膜下腔出血后,c IAP1/2、TLR4、p-ERK和p-JNK蛋白表達(dá)增加,Peli1的表達(dá)趨勢(shì)與炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)相關(guān)。4、蛛網(wǎng)膜下腔出血后,i NOS蛋白表達(dá)增加,并且Peli1和CD16/32共表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。第二部分1、Peli1重組慢病毒干擾載體轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞后,熒光定量PCR結(jié)果顯示,以Peli1-KD2干擾效率最高。2、經(jīng)側(cè)腦室注射Peli1慢病毒干擾載體預(yù)處理后,蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Peli1蛋白表達(dá)顯著降低。3、Peli1的下調(diào),提高了蛛網(wǎng)膜下腔出血后Garcia評(píng)分,減輕了腦水腫。4、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Western blot結(jié)果顯示,Peli1下調(diào)后,Bax蛋白表達(dá)降低,Bcl2蛋白表達(dá)增加。并且,Peli1下調(diào)導(dǎo)致p-JNK和p-ERK蛋白表達(dá)降低。此外,ELISA結(jié)果顯示,Peli1下調(diào)導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h細(xì)胞因子IL-6水平下降。5、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Western blot結(jié)果顯示,Peli1下調(diào)后,i NOS蛋白表達(dá)降低。6、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Western blot結(jié)果顯示,Peli1下調(diào)后,c IAP1/2和K48蛋白表達(dá)降低,但TLR4和My D88蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變。第三部分1、免疫熒光染色結(jié)果顯示,蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,TLR4和IBA1共表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞。2、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,TLR4抑制劑TAK242提高了Garcia評(píng)分。3、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Western blot結(jié)果顯示,TAK242處理抑制了TLR4和My D88蛋白水平,并降低了p-JNK和p-ERK蛋白表達(dá)水平。4、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Western blot結(jié)果顯示,TAK242處理后,Bax蛋白表達(dá)降低,Bcl2蛋白表達(dá)增加。5、蛛網(wǎng)膜下腔出血后48 h,Western blot結(jié)果顯示,TAK242治療降低了i NOS蛋白表達(dá),但對(duì)Peli1和c IAP1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。結(jié)論:第一部分1、小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后,Peli1表達(dá)增加,并且和炎癥調(diào)節(jié)通路相關(guān)蛋白(c IAP1/2、TLR4、p-ERK和p-JNK)相關(guān),提示Peli1可能參與蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥調(diào)節(jié)。2、小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后,Peli1主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),并且和M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化密切相關(guān)。第二部分1、下調(diào)Peli1表達(dá)能夠顯著減少小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥因子合成,抑制M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化,抑制細(xì)胞凋亡,減輕腦水腫,改善神經(jīng)功能缺陷,在早期腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。2、實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后Peli1主要通過(guò)介導(dǎo)c IAP1/2蛋白表達(dá)增加,從而激活My D88依賴(lài)的MAPK信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥因子合成。第三部分1、TLR4信號(hào)通路在蛛網(wǎng)膜下腔出血后依賴(lài)My D88途徑激活MAPK信號(hào)通路,從而介導(dǎo)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化。2、TAK242通過(guò)作用于TLR4信號(hào)通路,抑制MAPK信號(hào)通路,阻止M1型小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
【圖文】：

小鼠SAH血管穿刺模型示意圖

C SAH 血管穿刺圖。A:顯露頸總動(dòng)脈；B:結(jié)扎頸外動(dòng)脈；C:顯穿刺線(xiàn)置入頸內(nèi)動(dòng)脈ascular puncture of SAH model in mice.A: Exposure of commo of external carotid artery; C: Exposure of internal carotid artefilament was advanced into the internal carotid artery.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R743.35;R651.15

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本文編號(hào)：2618075