【摘要】：[目的]：1.探討攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的慢病毒載體感染人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)的最佳條件及其對hADSCs成脂分化能力的影響；2.hADSCs與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)建立共培養(yǎng)體系,與絲素蛋白支架聯(lián)合構(gòu)建組織工程脂肪的可行性；3.慢病毒介導(dǎo)VEGF165感染hADSCs與HUVEC共培養(yǎng)構(gòu)建的脂肪組織工程修復(fù)大鼠后肢軟組織缺損。[方法]：1.從人體正常脂肪組織中提取出脂肪問充質(zhì)干細(xì)胞,體外培養(yǎng)并擴(kuò)增；行成脂及成骨誘導(dǎo)鑒定脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化特性,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子CD3、CD44、CD45、CD90;在不同的感染復(fù)數(shù)(MOI)條件下,對hADSCs感染8小時(shí)后觀察感染效果；流式細(xì)胞儀檢測感染效率；MTT法檢測感染對hADSCs的增殖能力的影響；對感染后的hADSCs 成脂誘導(dǎo) 14d,行油紅0染色后,應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件比較hADSCs的成脂能力；2.HUVEC的擴(kuò)增與表面分子CD31、CD34的測定；hADSCs與HUVEC增殖曲線的測定,觀察兩種細(xì)胞按照不同比例共培養(yǎng)時(shí)生長情況；將共培養(yǎng)細(xì)胞種植于絲素蛋白支架后行電鏡掃描觀察細(xì)胞在支架上的形態(tài)；成脂誘導(dǎo)14天后,油紅O染色及RT-PCR鑒定共培養(yǎng)組與單純hADSCs組成脂情況。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：選取Wistar大鼠18只,制成后肢軟組織缺損模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為三組,Ⅰ組：經(jīng)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的hADSCs與HUVEC構(gòu)成的共培養(yǎng)體系,Ⅱ組：單純經(jīng)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的hADSCs,Ⅲ組：為空白對照。分別將兩組細(xì)胞與多孔絲素蛋白支架聯(lián)合后,種植于大鼠模型的軟組織缺損處,于4w及8w取材,觀察構(gòu)建物在體內(nèi)的生長情況,并比較濕重,電鏡下觀察細(xì)胞的生長情況；行HE染色觀察構(gòu)建的工程脂肪成脂及血管化情況,油紅O染色觀察成脂情況。[結(jié)果]：1.脂肪組織中成功分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測CD44及CD90陽性,CD34及CD45陰性,多向分化能力。以MOI值1、10、25、50、75、100、150攜帶EGFP的慢病毒感染hADSCs時(shí),其感染效率依次為0.24%、13.48%、40.33%、89.27%、94.52%、98.49%和99.11%。以MOI值50感染iADSCs,比較感染前后細(xì)胞的增殖與成脂能力,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；2.流式細(xì)胞儀測定HUVEC表面分子CD31 (+), CD34馬陽性；MTT結(jié)果顯示HUVEC增殖速度快于1ADSCs,以 HUVEC:hADSCs為1：4比例共同培養(yǎng)3天后,細(xì)胞融合時(shí)兩者比例約為1：1；將共培養(yǎng)細(xì)胞接種于絲素蛋白支架,成脂誘導(dǎo)14天后,通過RT-PCR可成功測定出PPARγ2基因的表達(dá),油紅O染色表明成脂誘導(dǎo)后,兩組均能誘導(dǎo)出大量的脂肪細(xì)胞；3.飼養(yǎng)4w及8w后,大體標(biāo)本結(jié)果顯示均能修補(bǔ)軟組織缺損,比較兩組構(gòu)建物的濕重：VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培養(yǎng)組 VEGF165-hADSCs組,冰凍切片后行油紅O染色均可見紅染的脂滴,電鏡下共培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)明顯優(yōu)于較單純hADSCs組；HE染色兩組均有不同程度的血管化,但VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培養(yǎng)組血管數(shù)目明顯多于單純VEGF165-hADSCs組。[結(jié)論]：1.慢病毒感染ADSCs的最佳MOI值為50,感染后對hADSCs增殖,成脂能力無明顯影響；2. hADSCs可與HUVEC共同培養(yǎng),以1：4比例構(gòu)成共培養(yǎng)組與絲素蛋白聯(lián)合,可在絲素蛋白支架上成功構(gòu)建出工程脂肪。3.以慢病毒介導(dǎo)VEGF165感染的hADSCs與HUVEC共培養(yǎng)體系為種子細(xì)胞,有孔絲素蛋白為支架材料,所構(gòu)建的組織工程脂肪可有效修復(fù)大鼠軟組織缺損。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R622

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 劉毅;李世龍;惠玲;;轉(zhuǎn)染攜帶人胰島素基因慢病毒載體提高顆粒脂肪移植物存活率的實(shí)驗(yàn)研究[J];蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2014年01期

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3 王和庚;黎洪棉;崔世恩;徐昆明;;帶血管肌筋膜包埋脂肪干細(xì)胞載體復(fù)合物構(gòu)建血管化組織工程脂肪(英文)[J];中國組織工程研究;2013年18期

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本文編號：2576656