【摘要】：目的目前微針經(jīng)皮給藥技術(shù)的研究集中于促滲作用,忽略了該方法所致創(chuàng)傷的愈合過(guò)程。本研究旨在探討微針?biāo)缕つw創(chuàng)傷的愈合過(guò)程,同時(shí)研究其愈合過(guò)程對(duì)透明質(zhì)酸經(jīng)皮滲透能力的影響。方法1、剃除SD大鼠背部毛發(fā),觀察皮膚出血情況;切取剃毛后全層皮膚修剪皮下組織,觀察修剪前后皮膚層次;取全層皮膚、修剪皮下組織前后皮膚和微針針刺后皮膚行HE染色,組織學(xué)觀察角質(zhì)層完整性、修剪層次和針刺深度。2、用正交設(shè)計(jì)軟件專業(yè)版V3.1設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),以針頭型號(hào)G、透明質(zhì)酸分子量Mr、透皮時(shí)間T作為考察因素,每個(gè)因素4個(gè)水平,即針頭型號(hào)(無(wú)針頭、25G、22G、18G)、透明質(zhì)酸分子量(10kDa、100k Da、1000kDa、1500kDa)、透皮時(shí)間(1h、3h、5h、7h)。依據(jù)正交表L16(45),獲得16組實(shí)驗(yàn)組合。3、使用改良的Franz擴(kuò)散池進(jìn)行大鼠離體皮膚滲透實(shí)驗(yàn)。用大鼠透明質(zhì)酸酶聯(lián)免疫試劑盒(Rat HA ELISA KIT)測(cè)定每組實(shí)驗(yàn)樣品液內(nèi)的透明質(zhì)酸濃度,以每組實(shí)驗(yàn)樣品液的濃度減去相同透皮時(shí)間的空白對(duì)照組濃度作為考察指標(biāo),篩選和優(yōu)化最佳實(shí)驗(yàn)組合“G-Mr-T”。4、取3只已備皮的大鼠麻醉后,于脊柱兩側(cè)對(duì)稱部位畫直徑約1.5cm的圓圈,左右各三個(gè),圓圈內(nèi)分別使用22G微針陣列和18G微針陣列穿刺,照相、肉眼觀察并記錄皮膚反應(yīng)及愈合情況。5、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組:18只已備皮的SD大鼠,體重約180g,創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察、鈣黃綠素染色和HA經(jīng)皮滲透分別隨機(jī)抽取2只、6只和10只,腹腔注射水合氯醛(0.003mL·g-1)麻醉。按操作4進(jìn)行標(biāo)記,每2只大鼠的時(shí)間點(diǎn)設(shè)計(jì)如下:1只大鼠的左側(cè)圓圈由頭側(cè)向尾側(cè)分別設(shè)為0h、3h、6h,右側(cè)為9h、12h、15h,另1只的左側(cè)為18h、21h、24h,右側(cè)為正常對(duì)照、空白對(duì)照;微針針刺后,無(wú)菌紗布覆蓋,待其自然愈合,到每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后,取開(kāi)紗布,分別進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)操作。6、鈣黃綠素染色:用鈣黃綠素棉球覆蓋,避光染色10min,取開(kāi)棉球,用鹽水和酒精棉球交替擦拭各2遍,取全層皮膚稍微修剪皮下組織后置于載玻片,立即在熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)波長(zhǎng)490nm,發(fā)射波長(zhǎng)515nm,統(tǒng)計(jì)光斑數(shù),獲取熒光圖像。7、創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察:切取全層皮膚行HE染色,觀察組織學(xué)變化。8、透明質(zhì)酸體內(nèi)經(jīng)皮滲透:涂抹透明質(zhì)酸4h,用PBS液濕棉簽擦去表面滯留的HA,取下全層皮膚,清洗后將全層皮膚和皮下肉膜層分開(kāi),分別勻漿,采用Rat HA ELISA KIT測(cè)定透明質(zhì)酸濃度。9、正交設(shè)計(jì)軟件V3.1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的數(shù)據(jù)分析。皮膚和肉膜中HA含量用(?)±s表示。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本均數(shù)兩兩之間的比較用SNK-q檢驗(yàn)(n=5),P0.05為差異有顯著性。多個(gè)樣本率的比較用卡方分割法,為保證檢驗(yàn)假設(shè)中I型錯(cuò)誤a的概率不變(a=0.05),須重新規(guī)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a′(a′=a/2(k-1),其中a=0.05,k為實(shí)驗(yàn)組數(shù)),得出P0.00313為差異有顯著性。結(jié)果1、脊柱兩側(cè)毛發(fā)剃除干凈,未見(jiàn)傷痕及出血點(diǎn),角質(zhì)層、顆粒層、棘層、基底層及真皮層層次分明,角質(zhì)層完好無(wú)損,皮膚屏障結(jié)構(gòu)健全;修剪后皮膚未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)皮下組織及破洞,皮下面完整光滑,完整保留真皮層;微針陣列針刺皮膚后,作用部位角質(zhì)層破壞,刺入深度達(dá)真皮乳頭層。2、HA體外透皮正交實(shí)驗(yàn)中,針頭越粗、分子量越小、透皮時(shí)間越長(zhǎng),HA的透過(guò)量越多(P0.05)�！�18G-10k-7h”、“18G-100k-5h”、“22G-10k-5h”、“22G-100k-7h”組合的透過(guò)量(ng·L-1)分別為410.555、231.700、294.705、215.440,考慮分子量越大,其降解速度越慢,效果越持久,分子量定為100kDa;當(dāng)透皮時(shí)間在3~5h,其透皮速率最大,所以將透皮時(shí)間定為4h;而針頭型號(hào)在22G或18G中選擇,根據(jù)兩者的愈合過(guò)程擇優(yōu)而定。3、肉眼觀:22G微針針刺后15h基本愈合,而18G延遲到21h,兩種針型到24h基本恢復(fù)正常皮膚形態(tài)。因此,最優(yōu)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)組合確定為“22G-100k-4h”,選擇22G微針進(jìn)行在體鈣黃綠素染色、創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察和透明質(zhì)酸透皮實(shí)驗(yàn)。4、鈣黃綠素染色:22G微針針刺皮膚,經(jīng)過(guò)0h、3h、6h、9h、12h、15h的愈合過(guò)程后,行鈣黃綠素染色10min立即觀察,光斑個(gè)數(shù)小幅度減少,染色率分別為98.9%、97.8%、95.6%、94.4%、92.2%、91.1%,兩兩相比,染色率輕度下降(P0.00313);經(jīng)過(guò)18h、21h、24h的愈合過(guò)程后,光斑個(gè)數(shù)大幅度減少,染色率分別為3.3%、1.1%、2.2%,與0h相比,染色率大幅度降低(P0.00313)。隨著愈合時(shí)間的延長(zhǎng),熒光光斑輪廓逐漸變小,15h時(shí)微弱可見(jiàn),18h已無(wú)熒光光斑。5、創(chuàng)傷愈合組織學(xué)觀察:22G微針針刺后皮膚屏障破壞,深達(dá)真皮乳頭層,隨著愈合時(shí)間的延長(zhǎng),微孔收縮,尺寸變小。到18h,微孔被增生的表皮細(xì)胞覆蓋,皮膚屏障結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)。6、HA皮膚滯留量:正常對(duì)照組(無(wú)微針預(yù)處理的正常皮膚外用HA)皮膚HA含量與空白對(duì)照組(無(wú)微針預(yù)處理的正常皮膚外用PBS液)相同(P0.05)。22G微針針刺,分別經(jīng)過(guò)0h、3h、6h、9h、12h、15h愈合后,再涂抹HA,皮膚內(nèi)HA的含量均高于空白對(duì)照組(P0.05),且隨著愈合時(shí)間點(diǎn)的增加,皮膚HA的含量減少(P0.01);而經(jīng)過(guò)18h、21h、24h的愈合時(shí)間后,再給予HA,皮膚內(nèi)HA的含量與空白對(duì)照組相近(P0.05)。7、HA肉膜滯留量:22G針刺后分別經(jīng)過(guò)0h、3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h愈合后,再給予外用HA,肉膜層HA的含量與空白對(duì)照組相近(P0.05)。結(jié)論1、微針?biāo)缕つw創(chuàng)傷在24h內(nèi)愈合,皮膚屏障功能恢復(fù)。2、22G微針針刺后HA(Mr=100kDa)的透皮量增加。隨著微創(chuàng)傷的愈合,其透過(guò)量逐漸減少,18h后,創(chuàng)傷愈合,皮膚屏障功能恢復(fù),HA無(wú)法經(jīng)皮滲透。3、微針有助于大分子量(10kDa≤Mr≤1500kDa)HA透皮吸收。
【圖文】：

針刺和補(bǔ)充 HA 的同步化操作。然而水光看似完美，其缺點(diǎn)仍不可忽略。一般為 31G 針頭，外徑約 0.250mm，尺寸微小，其強(qiáng)度和剛度降低，刺中容易發(fā)生斷裂或屈曲等現(xiàn)象。此外，水光針是一種通過(guò)利用外力來(lái)補(bǔ) 的手段，由于壓力大，術(shù)后常伴隨紅斑、浮腫及淤青等不良反應(yīng)，水光針物質(zhì)成分注射到真皮淺層，若一次性大量補(bǔ)充肌膚營(yíng)養(yǎng)，無(wú)法及時(shí)被肌膚分吸收利用，，造成毛孔堵塞，容易形成閉合性粉刺，嚴(yán)重者出現(xiàn)異物肉芽腫破潰等副作用。臨床上常用的注射器 1ml、5ml、10ml，其針頭型號(hào)/外徑 25G/0.510mm、22G/0.710mm、18G/1.260mm，針刺后皮膚不僅可以完全同時(shí)增加其機(jī)械強(qiáng)度，減少斷裂及屈曲等現(xiàn)象，本研究將使用注射器制作大幅度降低了水光針存在的物理隱患。同時(shí)，在本研究中，微針作用后涂，HA 通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入皮下，能夠被肌膚吸收利用，大幅度降低良反應(yīng)及副作用的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)在使用的過(guò)程中出現(xiàn)不適可立即停止操作，救。因此，我們將使用不同針頭型號(hào)制成的微針針刺皮膚后，觀察其皮膚況及其對(duì) HA 透皮能力的影響，有助于美容行業(yè)的發(fā)展。

樣品最終稀釋濃度分別為 5 倍、2 倍）。將樣品加于孔底部，盡量不要觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。按圖2-1 進(jìn)行操作：（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及樣品濃度計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)，吸光度（Optical density，OD 值）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，每次測(cè)量均重設(shè)空白孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔，重置標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R622

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2563508