【摘要】：目前器官移植已成為治療相應(yīng)器官嚴(yán)重功能障礙的重要手段。肝移植是目前治療各種終末期肝病唯一有效的方法。免疫抑制劑的使用是預(yù)防肝移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的主要手段,但也能引起患者機(jī)體代謝的失衡和許多副作用。如何減少肝移植受者免疫抑制劑的使用,已經(jīng)成為移植學(xué)家們追求的目標(biāo)。體外光化學(xué)療法(extracorporeal photopheresis,ECP)于1987年引進(jìn)國內(nèi)并用于治療器官移植排斥反應(yīng),臨床觀察到有一定的療效。ECP是指將患者外周血處理后并從中分離出單個(gè)核細(xì)胞,再經(jīng)光敏劑8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)和長波紫外線(long wave ultraviolet,UVA)聯(lián)合作用后回輸入病人體內(nèi)的一種血液單采光化學(xué)療法。但ECP作用的具體機(jī)制至今尚未清楚。越來越多的證據(jù)表明,ECP主要是抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)的功能調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)的誘導(dǎo)作用。在體內(nèi)凋亡細(xì)胞攝取的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生免疫抑制調(diào)節(jié)作用也是ECP發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)的關(guān)鍵。ECP在以往的研究中主要集中在誘導(dǎo)移植受者的免疫耐受。我們首次用肝移植供者的脾臟和外周血為實(shí)驗(yàn)材料,研究脾淋巴細(xì)胞的凋亡,和未成熟樹突狀細(xì)胞(imature dendritic cells,imDC)的生成,有一定的創(chuàng)新性且有助于進(jìn)一步更好的研究受者的免疫耐受機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)就聯(lián)合應(yīng)用UVA和8-MOP誘導(dǎo)肝移植供者脾淋巴細(xì)胞的早期凋亡,并用供者的外周血經(jīng)rhGM-CSF、IL-4誘導(dǎo)產(chǎn)生imDC,旨在為進(jìn)一步研究移植受者的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。1、UVA聯(lián)合8-MOP誘導(dǎo)人脾淋巴細(xì)胞凋亡首先獲取肝臟移植供者的脾臟(人脾臟來源于解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科肝臟移植供者,肝源供者已簽署相關(guān)知情同意書并經(jīng)309醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)移植的系列規(guī)定),制備成淋巴細(xì)胞懸液,根據(jù)處理方式不同分為單純UVA處理組(uva組)、單純8-mop處理組(8-mop組)、uva聯(lián)合8-mop處理組(聯(lián)合組)、未經(jīng)uva照射和未添加8-mop處理組(空白對(duì)照組)。每組3例(多次進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn))。uva組于37℃50ml/lco2孵箱中孵育20min,采用照射強(qiáng)度為2j/cm2的光照輻射儀在無菌照射臺(tái)上照射9min,距uva光源距離為20cm;8-mop組先加入200ng/ml8-mop,再置于37℃50ml/lco2孵箱中孵育20min;聯(lián)合組先加入200ng/ml8-mop,置于37℃50ml/lco2孵箱中孵育20min后再將此人脾淋巴細(xì)胞懸液放于照射強(qiáng)度為2j/cm2,距uva光源20cm的無菌照臺(tái)上,照射9min;空白對(duì)照組僅單純培養(yǎng)人脾淋巴細(xì)胞。將上述不同處理后的人脾淋巴細(xì)胞懸液用rpmi1640培養(yǎng)液1200r/min離心5min,反復(fù)洗滌2次,再用rpmi1640完全培養(yǎng)基(含100ml/l胎牛血清)重懸細(xì)胞懸液,置于37℃50ml/lco2孵箱中培養(yǎng)過夜。24h后用annexinⅤ-fitc/pi細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒各組進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)不同處理后的人脾淋巴細(xì)胞的早期凋亡率。2、肝移植供者外周血制備未成熟的樹突狀細(xì)胞首先獲取肝移植供者的外周血約10ml(血液來源于解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科肝臟移植供者,肝源供者已簽署相關(guān)知情同意書并經(jīng)309醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)移植的系列規(guī)定),等量置于兩個(gè)15ml離心管內(nèi),標(biāo)記為誘導(dǎo)組和對(duì)照組,分別加入等量的人外周血淋巴細(xì)胞分離液,分離出單個(gè)核細(xì)胞,再分別加10mlrpmi1640洗滌兩次后,于顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),保證細(xì)胞存活率95%。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/l,分別接種于兩個(gè)6孔培養(yǎng)板(誘導(dǎo)組6例,對(duì)照組6例),置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h,清除懸浮細(xì)胞,兩組均加入rhgm-csf(500u/ml)2ul、rhil-4(1000u/ml)8ul吹打,混勻;48h后兩組均半量換液,加入rhgm-csf(500u/ml)1ul、rhil-4(1000u/ml)4ul吹打,混勻;96h后誘導(dǎo)組保持不變,對(duì)照組加入rhtnf-α3ul吹打,混勻,培養(yǎng)2天。在培養(yǎng)第6天,光鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)特征,再分別收取各組的6個(gè)培養(yǎng)孔的貼壁細(xì)胞。用pe或fitc標(biāo)記的cd80、cd83、cd11a和cd86抗體,流式細(xì)胞儀檢測(cè)dc的表型。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、uva聯(lián)合8-mop誘導(dǎo)人脾淋巴細(xì)胞凋亡:聯(lián)合組的人脾淋巴細(xì)胞的早期凋亡率為(98.45±0.54)%,明顯高于其他三組(p0.01)。uva組和8-mop組均高于對(duì)照組(p0.01)。各組的總凋亡率和早期凋亡率:聯(lián)合組的總凋亡率和早期凋亡率分別為(99.36±0.39)%,(98.45±0.54)%;8-mop組分別為(69.55±0.46)%,(64.68±0.74)%;uva組的分別為(65.42±0.36)%,(61.05±0.90)%;對(duì)照組分別為(15.53±0.45)%,(13.67±0.54)%。2、肝移植供者外周血制備未成熟的樹突狀細(xì)胞:光鏡下可見,培養(yǎng)第6天時(shí),誘導(dǎo)組細(xì)胞呈圓形,突起較少,呈現(xiàn)imdc狀態(tài)。對(duì)照組細(xì)胞外周可見突起和絨毛,表面結(jié)構(gòu)較完整,樹突狀結(jié)構(gòu)明顯,呈現(xiàn)成熟的樹突狀細(xì)胞(maturedendriticcells,mdc)的狀態(tài)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹突狀細(xì)胞的表型:誘導(dǎo)組在培養(yǎng)第6d檢測(cè)cd80為(22.63±3.56)%,cd86為(16.39±4.72)%,cd83為(8.58±1.72)%,cd11c為(70.56±10.22)%,符合imdc的表現(xiàn);對(duì)照組在培養(yǎng)6d時(shí)檢測(cè)cd80含量為(53.82±5.46)%,cd86含量為(46.65±6.35)%,cd83含量為(80.56±16.45)%,cd11c含量為(82.32±11.61)%,符合mdc的表現(xiàn)�？梢�,誘導(dǎo)組樹突狀細(xì)胞的cd80、cd86、cd83、cd11c的含量均顯著低于對(duì)照組(p0.01),且在光鏡下呈現(xiàn)出imdc的狀態(tài)。兩組檢測(cè)指標(biāo)和細(xì)胞的形態(tài)相符合。由此可知,用rhgm-csf聯(lián)合rhil-4的培養(yǎng)方法可成功用肝移植供者的外周血培養(yǎng)出imdc。本實(shí)驗(yàn)用ecp方法成功誘導(dǎo)出大量人脾臟凋亡細(xì)胞,尤其是早期凋亡細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯著高于其他各個(gè)處理組和空白對(duì)照組。在體外用rhgm-csf+rhil-4的方法可成功用肝移植供者的外周血培養(yǎng)出imdc,且在光鏡下呈現(xiàn)imdc的形態(tài)特征。早期凋亡人脾淋巴細(xì)胞和imdc在肝移植受者的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用中至關(guān)重要,我們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在大鼠的心臟移植排斥反應(yīng)中驗(yàn)證了兩者之間的相關(guān)關(guān)系,但在人的相對(duì)實(shí)驗(yàn)中目前的設(shè)備和實(shí)驗(yàn)試劑,存在一定缺陷,故其兩者反應(yīng)的具體機(jī)制尚未開展,有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R657.3

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本文編號(hào)：2562359