【摘要】：目的：在椎間盤退行性病變過(guò)程中,椎間盤內(nèi)微環(huán)境中IL-1p表達(dá)的升高被認(rèn)為是其重要的致病因素,而間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤退行性病變也被認(rèn)為是具有巨大潛力的治療策略。在眾多實(shí)驗(yàn)中間充質(zhì)干細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的髓核細(xì)胞分化特性,以及體外實(shí)驗(yàn)中良好的恢復(fù)椎間盤高度的能力,本實(shí)驗(yàn)將從體外評(píng)價(jià)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)白介素1p(IL-1β)干預(yù)后的髓核(NP)細(xì)胞保護(hù)修復(fù)能力。方法：1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定以及實(shí)驗(yàn)分組。一型膠原,二型膠原的細(xì)胞免疫組化鑒定。取三代BMSCs通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD29、CD31、CD45、CD90位點(diǎn)鑒定細(xì)胞純度。實(shí)驗(yàn)共分為三組：1.對(duì)照組：在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下24 h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。2.炎性干預(yù)組(A組)：在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。3.共培養(yǎng)組(B組)：在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后,更換含有完全培養(yǎng)基同時(shí)置入預(yù)先種入BMSCs細(xì)胞的transwell小室,共培養(yǎng)24h,三組實(shí)驗(yàn)都分為2個(gè)階段,時(shí)間各24h。2.Realtime-PCR:BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細(xì)胞中基因的表達(dá)。采用Realtime-PCR檢測(cè)三組獲得NP細(xì)胞的ADAMTS-4、5、7,MMP-3、13,TIMP-1的基因相對(duì)表達(dá)量。3.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：根據(jù)beyotime提供的Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū),對(duì)于三組細(xì)胞CASPASE-3的活性進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)還對(duì)于三組細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色,觀察三組細(xì)胞的TUNEL染色的活性,進(jìn)行比較。BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細(xì)胞凋亡比例變化。取各組NP細(xì)胞,使用Annexin V (PE)/PI流式試劑盒檢測(cè)凋亡的變化。在流式檢測(cè)中,加入直接共培養(yǎng)(C組),使用相同數(shù)量的GFP-BMSCs直接加入炎性因子損失的NP細(xì)胞中,觀察四組髓核細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化。4.細(xì)胞遷徙的檢測(cè)：對(duì)于Ong/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml濃度的IL-1β干預(yù)髓核細(xì)胞24h,將transwell板由換成8-μm孔徑的濾板,通過(guò)四組的比較,觀察BMSCs對(duì)于炎性損傷的NP細(xì)胞的遷徙能力。5.線粒體染色現(xiàn)象觀察：使用24孔提前鋪片,使用IL-1β(20ng/ml)干預(yù)NP細(xì)胞24h之后,加入使用帶有GFP熒光的BMSCs, GFP-BMSCs使用線粒體染料預(yù)染色,直接接觸共培養(yǎng)24h后,將細(xì)胞玻片取出在共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果：1.NP細(xì)胞、BMSCs純度鑒定。BMSCs傳至第3代通過(guò)流式細(xì)胞儀通過(guò)CD29、 CD31、CD45、CD90位點(diǎn)鑒定細(xì)胞純度,BMSCs的流式鑒定結(jié)果顯示90%以上的BMSCs表現(xiàn)為CD29,CD90陽(yáng)性,小于5%的BMSCs的CD31及CD45陽(yáng)性,細(xì)胞純度較好。髓核細(xì)胞免疫組化顯示的二型膠原表達(dá)較好,符合NP細(xì)胞的膠原表達(dá)特點(diǎn)。2.Realtime-PCR結(jié)果,相比于對(duì)照組,A組中ADAMTS-4,ADAMTS-5, ADAMTS-7,MMP-13,MMP-3表達(dá)顯著升高,五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而相比A組,B組各項(xiàng)退變指標(biāo)基因表達(dá)量顯著降低,五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：三組細(xì)胞TUNEL染色顯示炎性刺激組(A組)髓核細(xì)胞凋亡明顯增加,BMSCs共培養(yǎng)組(B組)對(duì)于炎性因子導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞的數(shù)量的增產(chǎn)生有效的抑制。在Caspase-3的檢測(cè)中,A組比較對(duì)照組caspase-3活性升高明顯,二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而相比于A組,B組中Caspase-3活性下降,二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Annexin V (PE)/PI流式結(jié)果,與對(duì)照組相比,A組NP細(xì)胞在炎性因子刺激下凋亡增加明顯,二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。經(jīng)過(guò)BMSCs間接共同培養(yǎng)(B組)后,相比于A組,NP細(xì)胞凋亡下降明顯,二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。Annexin V(PE)/PI流式結(jié)果中,直接共培養(yǎng)的結(jié)果(C組)和間接共培養(yǎng)組(B組)對(duì)凋亡都有抑制作用,但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.BMSCs遷徙結(jié)果：通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色后BMSCs細(xì)胞數(shù)量的比較,可以發(fā)現(xiàn),IL-1β濃度的不斷升高,即隨著炎性因子對(duì)于髓核細(xì)胞損傷的程度不斷增加,BMSCs對(duì)于髓核細(xì)胞的遷徙能力不斷增強(qiáng)。四組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。5.線粒體一體化結(jié)果：從圖可以看出GFP-BMSCs可以通過(guò)隧道納米管,將線粒體傳輸進(jìn)炎性損傷的NP細(xì)胞內(nèi),完成細(xì)胞之間的直接營(yíng)養(yǎng)作用。結(jié)論：BMSCs可通過(guò)旁分泌的方式,有效降低炎性所致的NP細(xì)胞退變和凋亡的比例,說(shuō)明BMSCs作為種子細(xì)胞在椎間盤退行性病變的治療中,對(duì)于椎間盤炎性環(huán)境的“治療”作用不可忽視。同時(shí)BMSCs可以炎性損傷的NP細(xì)胞進(jìn)行遷移,說(shuō)明BMSCs可以在椎間盤內(nèi)炎性內(nèi)環(huán)境嚴(yán)重的部位遷徙,發(fā)揮治療作用,以及我們觀察到在直接共培養(yǎng)的時(shí)候,BMSCs可以通過(guò)隧道納米管,向損傷的NP細(xì)胞傳輸線粒體,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)可以一定程度上模擬體內(nèi)干細(xì)胞治療過(guò)程,為更準(zhǔn)確的研究干細(xì)胞治療機(jī)制提供條件。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R681.53

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2552328