發(fā)布時間：2019-08-14 09:56

【摘要】：【目的】本研究旨在獲取非人靈長類動物雪旺細胞高效激活方法、高表達營養(yǎng)因子的關(guān)鍵技術(shù),制備出標(biāo)準(zhǔn)化非人靈長類動物脊髓損傷的模型,進而移植激活態(tài)的雪旺細胞修復(fù)靈長類動物損傷的脊髓,通過行為學(xué)評分,感覺誘發(fā)電位及運動誘發(fā)電位檢測、組織學(xué)等觀察其療效,建立療效評價平臺,確定激活態(tài)雪旺細胞移植修復(fù)脊髓損傷的移植時間與移植濃度,從而規(guī)范化細胞移植修復(fù)脊髓損傷的評價標(biāo)準(zhǔn),為臨床激活態(tài)雪旺細胞移植治療脊髓損傷提供參考指標(biāo)和依據(jù)。【方法】1.雪旺細胞原代培養(yǎng)前7天結(jié)扎食蟹猴雙下肢腓腸神經(jīng),采用胰酶和膠原酶兩種傳代純化雪旺細胞,體外培養(yǎng)5天后采用S100免疫熒光染色方法鑒定雪旺細胞,DAPI染色標(biāo)記細胞核,檢測雪旺細胞純度。2.分離純化培養(yǎng)雪旺細胞,加入重組白介素-11(IL-11)分別采用RT-qPCR和Western boltting檢測雪旺細胞髓鞘蛋白的表達,進一步檢測IL-11調(diào)控髓鞘蛋白表達的相關(guān)情況。3.采用SS-II型大動物脊髓打機器(打擊頭直徑5mm,打擊沖量50g×50mm)制作非人靈長類動物脊髓損傷模型。模型制作完成后,采用基本行為學(xué)評分,籠內(nèi)攀爬實驗,改良Tarlov評分等行為學(xué)評分系統(tǒng)和體感誘發(fā)電位、運動誘發(fā)電位神經(jīng)評分系統(tǒng)檢測雙下肢功能情況,確定脊髓損傷模型的穩(wěn)定性。4.食蟹猴脊髓損傷后7天,在損傷部位多點微量注射激活態(tài)雪旺細胞,每點微量注射10μl,共計30μl,細胞濃度:2-3×105/μl,純度95%,采用體感誘發(fā)電位、運動誘發(fā)電位及改良Tarlov評分等行為學(xué)評分方法檢測雙下肢功能,并通過HE染色方法和免疫組織化學(xué)染色觀察組織學(xué)變化�！窘Y(jié)果】1.經(jīng)過兩輪差速消化后,低濃度Ⅱ型膠原酶消化組雪旺細胞純度為(96.1±1.68)%;對照組雪旺細胞純度為(80.1±4.77)%,兩組之間存在顯著性差異,P0.01。2.白介素-11可以顯著提高雪旺細胞中周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22的表達水平,而對雪旺細胞中髓鞘堿性蛋白和髓鞘蛋白零的表達水平則沒無明顯影響,該生理作用可被JAK特異性抑制劑AG490所抑制。并且在經(jīng)過IL-11處理的SCs細胞中可以觀察到pJAK2(Y1007+Y1008)和pSTAT3(Y705)含量明顯高于對照組且伴隨著SCs中g(shù)p130表達的上調(diào)。3.脊髓損傷組食蟹猴雙下肢體感誘發(fā)電位和運動誘發(fā)電位潛伏期延遲,波幅降低,行為學(xué)評價顯示脊髓損傷組較假手術(shù)組雙下肢運動能力明顯下降。4.在脊髓脊髓磋傷后第7天,在損傷部位多點微量注射激活態(tài)雪旺細胞,每點微量注射10μl,共計30μl,細胞濃度:2-3×105/μl,移植組HE染色顯示空洞明顯小于損傷組,GFAP染色顯示膠質(zhì)瘢痕面積小于損傷組(P0.05),NF200染色顯示軸突生長大于損傷組(p0.05),行為學(xué)評分示移植組下肢功能恢復(fù)情況較損傷組有明顯的好轉(zhuǎn)�！窘Y(jié)論】1.確定了雪旺細胞的自體來源,利用較少的神經(jīng)組織在短時間內(nèi)獲得大量高純度雪旺細胞。并且該培養(yǎng)方法未使用毛喉素等促進有絲分裂劑和阿糖胞苷等抑制成纖維細胞生長的物質(zhì),符合臨床應(yīng)用的要求,為自體雪旺細胞移植在臨床的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2.IL-11可通過調(diào)劑gp130/JAK2/STAT3信號通路以促進雪旺細胞中周圍神經(jīng)髓鞘蛋白22的表達,從而在體外能更好的激活雪旺細胞。3.體感誘發(fā)電位和運動誘發(fā)點位作為一種定量、客觀的脊髓電生理檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確性好,靈敏度高的特點,可作為非人靈長類動物肢體功能評價的依據(jù)。行為學(xué)評分作為一種經(jīng)典的評價方法,具有方便易行和經(jīng)濟實用的優(yōu)點。本研究將脊髓損傷模型與電生理檢測和行為學(xué)評分相結(jié)合,確保了模型制作的一致性,精確性,可重復(fù)性和經(jīng)濟實用性原則。4.在食蟹猴脊髓挫傷后第7天,在損傷部位多點微量注射激活態(tài)雪旺細胞,每點微量注射10μl,共計30μl,細胞濃度:2-3×105/μl,該移植途徑以及移植劑量可為臨床治療脊髓損傷提供一定的指導(dǎo)意義,從而使細胞治療脊髓損傷更具安全化,有效化,標(biāo)準(zhǔn)化。
【圖文】：

代培養(yǎng)48h后，鏡下可見細胞貼壁良好，其中混有較多成纖維細頭）（40x）細胞的純度鑒定顯微鏡下觀察，每組實驗細胞在600×高倍鏡下隨機選取5個視呈綠色的為S100陽性細胞，可鑒定為雪旺細胞。經(jīng)DAPI染色色，為細胞質(zhì)與細胞核合成(圖2)所示，僅有細胞核染色的細經(jīng)過計算，兩次純化后低濃度Ⅱ型膠原酶消化組SCs純度為（低濃度胰蛋白酶消化組SCs純度為（80.1±4.77）%。經(jīng)獨立樣本在顯著性差異，P<0.01（SPSS 22.0）。

論文 一．非人靈長類動物高純度雪旺細胞原代培養(yǎng)方法12圖2. 經(jīng)過2次純化后SCs免疫熒光染色。綠色熒光為S100，，代表SCs，僅有細胞核染色的細胞為成纖維細胞； DAPI染細胞核，（1）A、B、C為0.05%胰酶提純的SCs照片，D、E、F為0.05%Ⅱ型膠原酶提純的SCs照片；（2）圖A為圖B、C合并，圖D為圖E、F合并。（3）由圖可見，經(jīng)過低濃度Ⅱ型膠原酶提純的SCs純度明顯高于低濃度胰蛋白酶提純的SCs（600×）1.2.3. 雪旺細胞的增殖能力為了評估雪旺細胞的增殖能力，取經(jīng)過2次純化后的SCs接種在24孔板中
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.2

【參考文獻】

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本文編號：2526496