【摘要】：[目的]構建恒河猴HLA-G過表達腺病毒載體并鑒定；培養(yǎng)篩選恒河猴未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell, imDC)后用重組腺病毒載體進行轉染,western blot檢測HLA-G目的基因的表達情況。[方法](一)過表達腺病毒載體構建：將目的載體和含有目的基因的質粒進行酶切,酶切產物電泳回收后進行交換,其產物轉化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆進行菌落PCR鑒定,再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析,比對結果正確的即為構建成功的目的質粒。(二)目的質粒的表達檢測：用恒河猴HLA-G目的基因過表達真核質粒載體轉染293T細胞,western btot檢測目的質粒的表達情況。(三)AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)對恒河猴HLA-G過表達腺病毒載體進行包裝、擴增,Adeno-X純化試劑盒純化病毒,終點稀釋法檢測腺病毒滴度。(四)恒河猴樹突狀細胞的培養(yǎng)及腺病毒感染效率檢測。(五) Western blot檢測HLA-G在恒河猴未成熟樹突狀細胞中的表達。[結果]通過對長出的克隆進行菌落PCR鑒定,陽性轉化子PCR產物大小為618bp,與理論值相符。對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析,并且比對結果正確,表明成功構建了目的質粒。目的質粒轉染HEK293細胞,經western blot檢測,可以觀察到18KD附近有特征條帶,其大小與目的基因融合蛋白相吻合。結果說明目的基因過表達OK。經終點稀釋法測得腺病毒滴度為1×|011/ml。重組腺病毒感染恒河猴未成熟樹突狀細胞,western blot檢測見42KD處出現特異性條帶,與目的蛋白大小一致。[結論]通過HLA-G與腺病毒載體連接成功構建恒河猴HLA-G腺病毒載體,后續(xù)用重組腺病毒載體感染未成熟樹突狀細胞,經western blot檢測HLA-G可以在恒河猴imDC中穩(wěn)定的表達。[展望]通過重組腺病毒感染未成熟樹突狀細胞,希望獲得致耐受性樹突狀細胞,下一步將樹突狀細胞注射入受體門靜脈中研究恒河猴肝移植免疫耐受。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R617

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本文編號：2489741