【摘要】：研究背景乳腺癌和前列腺癌分別是女性和男性最常見的腫瘤類型,同時(shí)二者也分別占女性和男性因腫瘤死亡原因的第二位。惡性腫瘤細(xì)胞具有特殊的親骨性,使其易從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到骨微環(huán)境中,形成一繼發(fā)骨腫瘤病灶。80%以上的乳腺癌患者和90%以上的前列腺癌患者可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。骨轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致嚴(yán)重的骨痛、病理性骨折、致命性高鈣血癥及脊髓壓迫等骨相關(guān)事件(skeletal related events,SRE)。其中60%的患者可發(fā)生病理性骨折,20%的患者可發(fā)生高鈣血癥,而10%的患者可發(fā)生脊髓壓迫,這些均嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。腫瘤骨轉(zhuǎn)移的本質(zhì)在于腫瘤細(xì)胞與骨髓內(nèi)多種細(xì)胞的相互作用。腫瘤細(xì)胞分泌甲狀旁腺相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHr P)等因子直接或間接作用于并調(diào)控成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的分化及活性,而后骨基質(zhì)溶解及骨骼細(xì)胞可釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等多種因子又進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和血管發(fā)生等,形成所謂的“惡性循環(huán)”。目前臨床上已采用雙磷酸鹽、RANKL單抗等抗骨質(zhì)吸收的藥物用于腫瘤骨轉(zhuǎn)移的防治,可患者患者的骨痛等癥狀,但并不能提高患者的生存時(shí)間,臨床效果仍有待進(jìn)一步的提高。臨床上根據(jù)病理學(xué)及放射學(xué)表現(xiàn),可將腫瘤骨轉(zhuǎn)移分為溶骨性、成骨性和混合性三種。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移通常為溶骨性,而前列腺癌骨轉(zhuǎn)移通常為成骨性。同時(shí)應(yīng)該注意的是,15%~25%的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者可發(fā)生成骨性骨損害。在骨微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞相互作用,影響了正常的由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收間的骨重建平衡。研究表明,腫瘤細(xì)胞可分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白、內(nèi)皮素1等因子促進(jìn)新骨的形成。但腫瘤骨轉(zhuǎn)移的詳細(xì)分子機(jī)制仍存在許多不清楚的地方,進(jìn)一步研究腫瘤骨損害的相關(guān)因子具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Sema 3A在正常生理狀態(tài)下對(duì)骨重建具有重要的影響。Hayashi等研究發(fā)現(xiàn),成骨細(xì)胞分泌的Sema 3A對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化成熟具有雙向調(diào)節(jié)能力。Sema 3A通過(guò)與特異性受體NRP1結(jié)合,激活經(jīng)典wnt/β-catenin通路,促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)移,進(jìn)而與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化及其介導(dǎo)的骨形成。同時(shí)Sema 3A可抑制破骨前體細(xì)胞中plexina1-trem2-dap12復(fù)合體的形成,下調(diào)itam介導(dǎo)的共刺激通路和nfatc1的核表達(dá),進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的分化和其介導(dǎo)的骨吸收。目前sema3a在腫瘤成骨性骨轉(zhuǎn)移中的作用及潛在的機(jī)制仍不清楚。sema3a/nrp1信號(hào)通路是否參與成骨性骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化成熟,還不得而知。本課題通過(guò)建立一個(gè)模擬腫瘤細(xì)胞調(diào)控成骨前體細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞分化成熟的體外培養(yǎng)模型,深入研究sema3a在腫瘤介導(dǎo)的成骨性骨損害過(guò)程中的作用及具體分子機(jī)制。研究方法一、sema3a在不同骨轉(zhuǎn)移類型腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量pcr、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光等方法檢測(cè)sema3a在乳腺癌mda-mb-231、mcf-7細(xì)胞系和前列腺癌細(xì)胞lncap、pc-3、c4-2的表達(dá)水平,篩選sema3a高表達(dá)細(xì)胞系。二、sema3a在成骨性腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的成骨分化過(guò)程中作用利用shrna慢病毒構(gòu)建sema3a低表達(dá)的乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞系,或采用sema3a特異性中和抗體處理乳腺癌mcf-7和前列腺癌細(xì)胞c4-2,制備相應(yīng)的條件培養(yǎng)基(conditionedmedium,cm),干預(yù)成骨前體細(xì)胞mc3t3-e1的成骨細(xì)胞分化,并進(jìn)行如下檢測(cè):1.利用堿性磷酸酶(alikalinephosphatase,alp)活性檢測(cè)和alp染色法檢測(cè)各組細(xì)胞alp活性。2.利用茜素紅s染色檢測(cè)各種細(xì)胞骨結(jié)節(jié)礦化形成情況。3.利用qpcr技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞成骨標(biāo)志基因alp、runx2、col1α1、ocn及osterix的相對(duì)表達(dá)量。4.利用蛋白印跡法檢測(cè)成骨前體細(xì)胞表面sema3a特異性受體nrp1的表達(dá)以及β-catenin的活化。三、sema3a在成骨性腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的破骨分化過(guò)程中作用利用小鼠單核細(xì)胞raw264.7和小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bonemarrow-derivedmacrophages,bmms)作為破骨前體細(xì)胞模型,同樣采用shrna慢病毒和中和抗體檢測(cè)sema3a在成骨性腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程中作用。主要的檢測(cè)方法:1.利用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,trap)染色檢測(cè)破骨細(xì)胞特異性分化情況。2.掃描電鏡檢測(cè)骨吸收陷窩形成情況。3.利用qpcr技術(shù)檢測(cè)破骨分化標(biāo)志基因ck、trap及ctr的相對(duì)表達(dá)量。4.利用western-blot蛋白印跡法檢測(cè)raw264.7細(xì)胞表面nrp1的表達(dá)以及itam下游plc的活化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、sema3a在不同骨轉(zhuǎn)移類型腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的檢測(cè)1.在成骨性乳腺癌mcf-7細(xì)胞中,sema3a的mrna和蛋白表達(dá)水平明顯高于溶骨性乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞;2.在具有明顯促成骨能力的前列腺癌細(xì)胞c4-2細(xì)胞中,sema3a的mrna和蛋白表達(dá)水平明顯高于lncap和pc-3細(xì)胞。二、sema3a在成骨性腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的成骨分化過(guò)程中作用1.不同骨轉(zhuǎn)移類型乳腺癌細(xì)胞對(duì)成骨分化的調(diào)控作用alp活性及染色、ars染色及成骨標(biāo)志基因的檢測(cè)提示:乳腺癌mcf-7細(xì)胞可明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,而乳腺癌mda-mb-231細(xì)胞可明顯抑制成骨細(xì)胞分化。2.shrna慢病毒可有效建立穩(wěn)定的sema3a低表達(dá)mcf-7和c4-2細(xì)胞免疫印跡結(jié)果顯示,shrna慢病毒感染并經(jīng)嘌呤霉素篩選后,mcf-7和c4-2細(xì)胞中sema3a的mrna和蛋白表達(dá)水平均明顯下降,表明建立穩(wěn)定的sema3a低表達(dá)細(xì)胞系。3.sema3a參與乳腺癌mcf-7細(xì)胞介導(dǎo)的成骨分化作用sema3ashrna干擾可明顯抑制mcf-7細(xì)胞cm介導(dǎo)的促成骨分化作用,中和抗體的實(shí)驗(yàn)也同樣驗(yàn)證了這一結(jié)果。4.sema3a參與前列腺癌c4-2細(xì)胞介導(dǎo)的成骨分化作用alp活性及染色、ars染色及成骨標(biāo)志基因的檢測(cè)提示:sema3ashrna干擾前列腺癌c4-2細(xì)胞sema3a的表達(dá)后,其腫瘤細(xì)胞cm介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化明顯受到抑制。5.腫瘤細(xì)胞來(lái)源的sema3a通過(guò)nrp1作用于成骨細(xì)胞,并促進(jìn)wnt/β-catenin通路的活化shrna慢病毒干擾mcf-7細(xì)胞中sema3a的表達(dá)后,其對(duì)mc3t3-e1細(xì)胞上特異性受體nrp1的刺激作用明顯低于mcf-7cm組。mcf-7cm組和mcf-7nccm組可明顯促進(jìn)成骨前體細(xì)胞細(xì)胞核中β-catenin的蛋白水平;干擾mcf-7細(xì)胞sema3a的表達(dá)后,細(xì)胞核中β-catenin的蛋白水平明顯降低,而胞漿中p-β-catenin的蛋白水平明顯升高。三、Sema3A在成骨性腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化過(guò)程中作用1.乳腺癌MCF-7細(xì)胞可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的破骨分化MCF-7細(xì)胞CM可明顯促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞CK、TRAP、CTR三個(gè)破骨分化標(biāo)志基因的mRNA表達(dá);TRAP染色結(jié)果也具有相同的趨勢(shì)。2.Sema 3A減弱MCF-7 CM介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化和骨吸收實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,干擾MCF-7細(xì)胞中Sema 3A的表達(dá)后,可進(jìn)一步增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞CK、TRAP表達(dá)的促進(jìn)作用;TRAP染色結(jié)果顯示,干擾MCF-7細(xì)胞中Sema 3A的表達(dá)后,可進(jìn)一步增強(qiáng)TRAP陽(yáng)性多核細(xì)胞的數(shù)目;骨吸收陷窩SEM結(jié)果顯示,干擾MCF-7細(xì)胞中Sema 3A的表達(dá)后,可進(jìn)一步增強(qiáng)MCF-7 CM介導(dǎo)的骨吸收。BMM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相同的變化趨勢(shì)。3.Sema 3A促進(jìn)破骨前體細(xì)胞NRP1的表達(dá),抑制PLCγ的磷酸化水平抑制MCF-7細(xì)胞中Sema 3A的表達(dá)后,其對(duì)NRP1表達(dá)的促進(jìn)作用明顯減弱。RAW264.7細(xì)胞中PLCγ的磷酸化水平與RANKL的誘導(dǎo)呈時(shí)間依賴關(guān)系。抑制MCF-7細(xì)胞中Sema 3A的表達(dá)后,PLCγ的磷酸化水平明顯增高。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)分析了不同骨轉(zhuǎn)移類型(成骨性、溶骨性和混合性)乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞中Sema 3A這一作為骨代謝重要因子的表達(dá)情況,并探討其對(duì)腫瘤成骨性骨轉(zhuǎn)移病理過(guò)程中成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞分化和活性的調(diào)控作用。主要的結(jié)論如下:1成骨性骨轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞(MCF-7和C4-2)具有較高的Sema 3A表達(dá)水平,而溶骨性骨轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞(MDA-MB-231和PC-3)中Sema 3A的表達(dá)水平較低;2成骨性腫瘤細(xì)胞分泌的Sema 3A,可作用于成骨前體細(xì)胞上特異性受體NRP1,增強(qiáng)成骨前體細(xì)胞內(nèi)β-catenin的活性,促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和其介導(dǎo)的骨形成。3腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Sema 3A作用于破骨前體細(xì)胞上NRP1受體,抑制RANKL介導(dǎo)的ITAM共刺激通路和下游PLCγ的活化,進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收活性。綜上,腫瘤細(xì)胞來(lái)源的Sema 3A通過(guò)對(duì)骨微環(huán)境中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的雙向調(diào)控作用,其可能促進(jìn)了腫瘤成骨性骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Graziana Colaianni;Giacomina Brunetti;Maria Felicia Faienza;Silvia Colucci;Maria Grano;;Osteoporosis and obesity: Role of Wnt pathway in human and murine models[J];World Journal of Orthopedics;2014年03期

2 湯昊;張征宇;;前列腺癌骨轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展[J];中華男科學(xué)雜志;2010年04期

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本文編號(hào)：2453149