【摘要】：研究背景:椎間盤主要由3個(gè)部分組成,即內(nèi)部膠凍樣的髓核組織,外圍包繞著髓核的纖維環(huán)組織,以及上下兩端的軟骨終板。椎間盤不但參與脊柱的屈,伸、旋轉(zhuǎn)等運(yùn)動(dòng),還幫助脊柱適應(yīng)承載負(fù)荷,分散應(yīng)力等。而髓核細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于維持椎間盤生理功能最為重要。髓核細(xì)胞能夠分泌蛋白聚糖,其中以聚蛋白聚糖(Aggrecan)為主,及各型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分,蛋白聚糖含量最高,約占髓核干重的50%以上。因此,蛋白聚糖的降解是椎間盤退變的重要因素之一。含有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素與金屬蛋白酶(A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motif,ADAMTS)家族成員中的ADAMTS-4和ADAMTS-5是目前公認(rèn)最重要的聚蛋白聚糖酶。前期研究已經(jīng)證實(shí)退變椎間盤微環(huán)境中的炎癥因子如TNF-α,IL-1β等能夠刺激髓核細(xì)胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5的高表達(dá),從而降解聚蛋白聚糖,在椎間盤退變的過(guò)程具有重要作用。因此對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5的進(jìn)一步研究,將會(huì)使我們對(duì)椎間盤退變的分子機(jī)制有更進(jìn)一步的了解�；罨疶細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)家族包括NFAT1-4以及NFAT5。其中NFAT1-4主要依靠鈣離子相關(guān)信號(hào)通路激活發(fā)揮作用,而NFAT5也被稱為滲透壓反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(osmotic response element binding protein,OREBP)或者彈性反應(yīng)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(tonicity-responsive enhancer binding protein,Ton EBP),該因子是目前哺乳動(dòng)物唯一已知的應(yīng)答于細(xì)胞外高滲透壓環(huán)境的轉(zhuǎn)錄因子。既往的研究證明鈣離子對(duì)聚蛋白聚糖合成具有重要作用。而在髓核細(xì)胞的研究中,鈣離子被證明促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的合成,并且有助于椎間盤承載負(fù)荷的能力。眾所周知,髓核細(xì)胞處于細(xì)胞外高滲透壓的微環(huán)境中。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為髓核細(xì)胞所處高滲環(huán)境不利于代謝反應(yīng),但是新近的研究表明髓核細(xì)胞高滲的環(huán)境可能通過(guò)活化Ton EBP,從而對(duì)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮促合成效應(yīng)。目前,大部分關(guān)于鈣離子與高滲透壓對(duì)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)控研究主要集中于一些合成代謝因素,而對(duì)重要的分解代謝因素的調(diào)控卻罕有報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)首次研究了鈣離子和高滲透壓對(duì)降解聚蛋白聚糖的關(guān)鍵酶——ADAMTS-4和ADAMTS-5的調(diào)控作用,并且檢測(cè)了NFAT家族因子在該調(diào)控中的作用。目的:研究鈣離子和高滲透壓對(duì)髓核細(xì)胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5表達(dá)的調(diào)控作用,探討鈣離子和高滲透壓對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5調(diào)控過(guò)程中可能參與的信號(hào)通路(NFAT因子)。方法:體外培養(yǎng)大鼠髓核細(xì)胞,使用10mM NaCl溶液調(diào)整培養(yǎng)基滲透壓(330osm,450osm,550osm)。隨后,使用調(diào)整滲透壓后的培養(yǎng)基處理髓核細(xì)胞24小時(shí)。用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)以及免疫印跡(western blot)方法檢測(cè)髓核細(xì)胞ADAMTS-4,ADAMTS-5 m RNA及蛋白水平表達(dá)的變化。構(gòu)建人PGL3-ADAMTS4,PGL3-ADAMTS5雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞以檢測(cè)高滲透壓對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5啟動(dòng)子水平的調(diào)控作用。采用western blot檢測(cè)高滲透對(duì)髓核細(xì)胞中Ton EBP表達(dá)的調(diào)控作用;使用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)分析ADAMTS-4,ADAMTS-5啟動(dòng)子片段中可能的NFAT家族結(jié)合位點(diǎn)。用Ton EBP過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與ADAMTS-4或ADAMTS-5報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,以明確Ton EBP信號(hào)通路在其中的作用。使用顯性負(fù)突變(Dominant negative)Ton EBP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,以進(jìn)一步明確Ton EBP在高滲調(diào)控ADAMTS-4與ADAMTS-5表達(dá)中的作用。用ionomycin和PMA一起干預(yù)髓核細(xì)胞24小時(shí)。隨后,使用real-time RT-PCR分別檢測(cè)ADAMTS-4與ADADAMTS-5 m RNA水平的變化,以檢測(cè)鈣離子的作用。轉(zhuǎn)染PGL3-ADAMTS4,PGL3-ADAMTS5雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒后,用BAPTA-AM或Cs A和FK506干預(yù)細(xì)胞24小時(shí),以進(jìn)一步明確鈣離子及鈣調(diào)磷酸酶在啟動(dòng)子水平對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-4的調(diào)控作用。最后,用NFAF1,2,3,4質(zhì)粒與ADAMTS-4或ADAMTS-5報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,已明確NFAT家族對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5的調(diào)控作用。結(jié)果:Real-time RT-PCR與western blot結(jié)果顯示高滲透壓能夠抑制髓核細(xì)胞中ADAMTS-4,ADAMTS-5 m RNA與蛋白水平的表達(dá)。成功構(gòu)建ADAMTS-4,ADAMTS-5雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,并用JASPAR軟件分析ADAMTS-4,ADAMTS-5的啟動(dòng)子片段,發(fā)現(xiàn)該ADAMTS-4啟動(dòng)子片段含有2個(gè)可能的NFAT家族結(jié)合原件,而該ADAMTS-5啟動(dòng)子片段含有3個(gè)可能的NFAT家族結(jié)合原件。Western blot結(jié)果顯示高滲透壓能夠上調(diào)髓核細(xì)胞中Ton EBP的蛋白含量。將DN-Ton EBP質(zhì)粒與ADAMTS-4或ADAMTS-5報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)DN-Ton EBP對(duì)ADAMTS-4啟動(dòng)子活性沒(méi)有明顯作用,而DN-Ton EBP卻阻滯了高滲對(duì)ADAMTS-5的抑制作用,同樣,Ton EBP對(duì)ADAMTS-4啟動(dòng)子活性也沒(méi)有明顯作用,而Ton EBP對(duì)ADAMTS-5顯示出強(qiáng)烈的抑制作用。ionomycin和PMA干預(yù)細(xì)胞后,real-time RT-PCR結(jié)果證實(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子能夠上調(diào)ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達(dá)。而BAPTA-AM或者Cs A和FK506干預(yù)細(xì)胞后,拮抗了ionomycin和PMA對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5啟動(dòng)子的激活作用。而NFAT-1,2,3,4轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,顯示NFAT-1對(duì)ADAMTS-4啟動(dòng)子活性具有抑制作用,對(duì)ADAMTS-5啟動(dòng)子活性具有刺激作用,而NFAT-2與NFAT-3對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5啟動(dòng)子活性具有刺激作用,NFAT-4對(duì)二者啟動(dòng)子活性無(wú)明顯調(diào)控作用。結(jié)論:1.高滲透壓在m RNA水平與蛋白水平均對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5具有抑制作用,并且該抑制作用在髓核組織正常生理滲透壓范圍內(nèi)表現(xiàn)出劑量依賴性。2.高滲透壓在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)ADAMTS-4和ADAMTS-5也具有抑制作用,并且對(duì)ADAMTS-5的抑制作用是通過(guò)Ton EBP進(jìn)行調(diào)控的,而對(duì)ADAMTS-4的抑制作用卻不依賴于Ton EBP。3.鈣離子能夠刺激ADAMTS-4和ADAMTS-5啟動(dòng)子活性,并且這一調(diào)控過(guò)程與鈣調(diào)磷酸酶有關(guān)。4.ADAMTS-4和ADAMTS-5的啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)可能均存在NFAT家族結(jié)合原件,這表明NFAT家族對(duì)二者具有一定的調(diào)控能力。其中NFAT-1對(duì)ADAMTS-4啟動(dòng)子活性具有抑制作用,但是對(duì)ADAMTS-5卻表現(xiàn)出刺激作用,而NFAT-2與NFAT-3對(duì)二者啟動(dòng)子活性均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的刺激作用,而NFAT-4對(duì)二者啟動(dòng)子均沒(méi)有明顯的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R68

【共引文獻(xiàn)】

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3 廖文杰;CaN-NFATs-ET1通路在肺癌細(xì)胞A549增殖中的作用[D];南昌大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2448068