【摘要】：【背景】人游離皮瓣移植越來越廣泛應(yīng)用于修復(fù)嚴(yán)重創(chuàng)傷和腫瘤等造成的皮膚軟組織缺損,目前游離皮瓣的存活率仍然只有95%。以往的研究認(rèn)為影響皮瓣存活的因素很多,其中皮瓣缺血再灌注損傷是影響皮瓣的存活的一個(gè)重要的因素。確保游離皮瓣完全存活,提高皮瓣存活率是整形醫(yī)生首要目標(biāo)。研究者們發(fā)現(xiàn)通過藥理學(xué)和機(jī)械的干預(yù)能夠減輕再灌注損傷,但是藥物干預(yù)在臨床上的運(yùn)用仍然受到限制。“缺血后處理”為長期缺血后以及再灌注之前進(jìn)行的一系列的機(jī)械重復(fù)周期短暫的再灌注和再阻斷血流循環(huán)。目前,缺血后處理的保護(hù)作用已經(jīng)在家兔、大鼠的游離皮瓣得到證實(shí);但是還未有人的皮瓣相關(guān)的研究,并且后處理的保護(hù)作用研究機(jī)制并不清楚。本研究是想通過建立人皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞低氧后處理模型,模擬在體的缺血后處理,研究缺血后處理的保護(hù)作用,為具體的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)�！灸康摹繀⒖紘鴥�(nèi)外皮瓣真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞提取方法,采用酶消化加磁珠分選的方法提取人皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞。確定低氧后處理的最佳的缺氧和復(fù)氧時(shí)間,建立低氧后處理模型�！痉椒ā坎捎妹赶�(lián)合磁珠分選法得到人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMECs),體外培養(yǎng)傳至P5代,采用Ⅷ因子免疫熒光及CD309、CD34流式細(xì)胞學(xué)進(jìn)行鑒定;檢測乳酸脫氫酶(LDH)在隨缺氧時(shí)間含量的變化;Tunel法染色計(jì)算各組的細(xì)胞凋亡率;用Western Blot的方法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3以及活化Caspase-3的蛋白含量表達(dá)�！窘Y(jié)果】1.細(xì)胞分離培養(yǎng)4d后,可見散在的細(xì)胞集落,周邊有成纖維狀細(xì)胞生長,細(xì)胞集落,生長7d后,可見細(xì)胞呈鋪路石樣排列;2.經(jīng)第2次分選,可見細(xì)胞呈緊密排列的漩窩狀或同心圓狀外觀,呈鋪路石樣排列。第二次CD31磁珠分選后陽性率95%;3.二次CD31磁珠分選后流式細(xì)胞鑒定結(jié)果:CD309陽性率為(95.4±1.34)%;CD34陽性率為(42.5±3.23)%;4.免疫熒光檢測上清液中LDH:結(jié)果LDH隨著缺氧時(shí)間的增加而加,8h與0h、2h、4h、6h相比LDH含量顯著增加p0.05,8h與12h差異性不顯著p0.05;5.Tunel和Western結(jié)果顯示2min*3s和5min*3s的缺氧后處理(hypoxic postconditioning,H-post C)能夠起到保護(hù)作用;【結(jié)論】1.根據(jù)細(xì)胞的集落形態(tài)以及免疫熒光和流式的結(jié)果分析得出,消化酶加CD31磁珠分選真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDECMs)的辦法穩(wěn)定可靠;2.根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)隨缺氧時(shí)間變化的結(jié)果,確定最佳的缺氧時(shí)間;3.通過Tunel凋亡染色檢測細(xì)胞凋亡比率;蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)檢測Bax、Bcl-2和活化的Caspase-3、Caspase-3蛋白含量的表達(dá),建立了人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的低氧后處理模型,其中2min*3s和5min*3s是最好的后處理循環(huán)次數(shù)和持續(xù)時(shí)間�！居懻摗勘狙芯砍晒Φ牟捎肅D31磁珠分選的方法提取并培養(yǎng)了HDMECs,采用Ⅷ因子免疫熒光進(jìn)行鑒定,初步證實(shí)為HDMECs;同時(shí)采用CD34和CD309流式抗體檢測細(xì)胞的生物學(xué)特征,這樣能更方便我們在體外研究HDMECS的生理和病理生理特征。根據(jù)WB和Tunel結(jié)果分析我們同樣發(fā)現(xiàn),單純低氧8h/復(fù)氧24h,活化的caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2以及細(xì)胞凋亡的比例高于其他組。并且2min*3s和5min*3s的缺氧后處理能夠抑制細(xì)胞凋亡,但是在10min*3s、20min*3s缺氧后處理并不能達(dá)到理想的保護(hù)作用。因此我們推測在皮瓣微血管內(nèi)皮細(xì)胞中,適當(dāng)?shù)暮筇幚頃r(shí)間能夠通過降低Bax/Bcl-2,活化的caspase-3/caspase-3的比例,達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用。所以說我們成功的建立了人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的低氧后處理模型。
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【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R622

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;Preconditioning and postconditioning reduce hepatic ischemia-reperfusion injury in rats[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2009年06期

2 胡大海,陳璧,湯朝武,韓軍濤,姜篤銀,蘇映軍,朱雄翔,賈赤宇,徐明達(dá);人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離和原代培養(yǎng)[J];西北國防醫(yī)學(xué)雜志;1999年04期

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本文編號：2400046