發(fā)布時(shí)間：2018-12-28 07:28

【摘要】：目的皮膚作為人體最大的器官,其在調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝廢物以及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面均發(fā)揮著重要作用。但是,皮膚在日常生活以及戰(zhàn)(創(chuàng)、燒)傷中也最易受到損傷。輕度受損的皮膚可以依據(jù)其未損傷的細(xì)胞與組織為模板,依靠皮膚自身的再生潛力完成其自我修復(fù)的過程；但重度大面積損傷的皮膚卻喪失其原有的組織結(jié)構(gòu)與功能,皮膚中具備修復(fù)潛能的干細(xì)胞與組織被嚴(yán)重破壞,其自我修復(fù)的潛能也隨之喪失殆盡。目前對(duì)于大面積深度燒傷的治療,仍存在諸多困難,如愈合后瘢痕攣縮、供體皮膚來源不足、異體或異種皮的免疫排斥反應(yīng)等。隨著組織工程學(xué)的誕生,人們開始應(yīng)用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)及醫(yī)學(xué)科學(xué)等原理和技術(shù)構(gòu)建各類皮膚替代物。因此,如何能在皮膚損傷的早期利用各項(xiàng)技術(shù)和措施來修復(fù)與重建損傷皮膚已經(jīng)成為當(dāng)前皮膚再生研究的新方向。脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)(acellular allogeneic dermal matrix, allo-ADM)是用理化方法脫除異體表皮和真皮中所有細(xì)胞成份,保留細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu),并完整保留位于表皮層和真皮層之間的基底膜。其具有完整的膠原三維結(jié)構(gòu)和高生物相容性,是一種良好的真皮替代物,在組織成分上與自體皮膚最相近,可以作為一種理想的皮膚移植物。由于除去了表皮和真皮中可引發(fā)被宿主識(shí)別的外來細(xì)胞成份從而去除了抗原性,移植在受體創(chuàng)面上不發(fā)生免疫排斥,為永久性真皮覆蓋物。Allo-ADM的存在為受體成纖維細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞重新定植和血管新生提供了良好的誘導(dǎo)支架,在allo-ADM中重新定居的成纖維細(xì)胞保持產(chǎn)生成熟基質(zhì)的能力。另外,基底膜的存在非常有利于表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖與分化。但由于基底膜仍具有較強(qiáng)的免疫原性,且異體皮來源主要來源為保存完好的尸體皮,來源十分有限,受到倫理學(xué)的制約,且存在有傳染疾病的危險(xiǎn),其應(yīng)用受到極大的限制。異種無細(xì)胞真皮基質(zhì)(xenogeneic acellular dermal matrix, xeno-ADM)也是真皮基質(zhì)的來源之一,最常用的異種真皮為豬皮。豬皮和人的皮膚在組織結(jié)構(gòu)物性狀和免疫方面有許多相似之處,且來源廣泛,是異種真皮的最佳材料。Xeno-ADM的制作同allo-ADM的制作基本相同,處理后也去除了誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分并且保留了完整的細(xì)胞外基質(zhì)。但由于物種間存在組織蛋白的差異,xeno-ADM的免疫原性要比allo-ADM強(qiáng)。Xeno-ADM的應(yīng)用存在缺陷：存在較強(qiáng)的免疫原性；血管化速度緩慢；潛在異源性病毒微生物感染風(fēng)險(xiǎn)。我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn),在深Ⅱ度燒傷和混合燒傷中,存在一種沒有全層壞死的特殊真皮組織,此類組織中可見細(xì)胞新陳代謝障礙、細(xì)胞功能低下、形態(tài)學(xué)改變等一系列變化,但在局部環(huán)境改善后,具有可逆恢復(fù)至正常形態(tài)和功能的特點(diǎn),通常把這部分沒有完全壞死的真皮稱為變性真皮。由于熱損傷等損傷因素存在,變性真皮中含有大量細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)降解物,其具有多種強(qiáng)大的生物學(xué)活性,包括誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、促進(jìn)細(xì)胞增殖等,稱為細(xì)胞外基質(zhì)活性肽。細(xì)胞外基質(zhì)活性肽可對(duì)傷患產(chǎn)生極大影響,可引起休克、心律失常等致命并發(fā)癥。以往的經(jīng)驗(yàn)是將變性皮膚視為焦痂或痂皮,將其切除后覆蓋臨時(shí)覆蓋物,近年來有學(xué)者提出可行磨痂術(shù)以保留變性真皮,可以促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。但其中的細(xì)胞外基質(zhì)活性肽仍然會(huì)對(duì)傷患產(chǎn)生不利影響。因此,我們提出,能否將燒傷皮膚完全切除,利用組織工程學(xué)相關(guān)處理措施,祛除其中的不利因素,利用其中的膠原成分和部分活性因子,變成一種新型的真皮支架,使其廢物利用,發(fā)揮更為合理、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用,既可以減少免疫排斥和炎性反應(yīng),又能加速燒傷創(chuàng)面的愈合。在本研究中,我們將深度燒傷皮膚進(jìn)行了組織工程學(xué)加工,將真皮基質(zhì)中的降解物進(jìn)行無害化處理,制作了深度燒傷真皮基質(zhì)(Deep-degree burned dermal matrix, DDBDM),對(duì)其進(jìn)行了理學(xué)性能及生物學(xué)性能初步評(píng)價(jià)。并選擇小鼠作為研究對(duì)象,針對(duì)其中的細(xì)胞因子進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片實(shí)驗(yàn),明確脫細(xì)胞措施對(duì)其中的細(xì)胞因子有何影響。材料與方法1.深度燒傷動(dòng)物模型的建立：選用Wistar大鼠、昆明小鼠、Balb/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,采用恒溫恒壓燙傷法及恒溫水浴燙傷法作為致傷方法,根據(jù)致傷深度均勻性及可重復(fù)性優(yōu)選出最佳的致傷方法。2. DDBDM的制備及其物理性能和生物相容性評(píng)價(jià)2.1 DDBDM的制備方法篩選及其優(yōu)化：切取燒傷部位皮膚進(jìn)行胰蛋白酶-Triton X-100方法進(jìn)行脫細(xì)胞處理,按其濃度不同分為A組：0.1%胰蛋白酶、0.1%Triton X-100組,B組：0.25%胰蛋白酶、0.5%Triton X-100組,C組：0.5%胰蛋白酶、1%Triton X-100組,設(shè)定恒溫振蕩儀于37℃,設(shè)定振蕩頻率為100rpm,設(shè)置不同振蕩時(shí)間1h、2h、4h,使用無菌PBS緩沖液進(jìn)行振蕩漂洗,直至PBS溶液變清亮。根據(jù)制得的真皮支架的完整性及其脫細(xì)胞的程度進(jìn)行制備條件的初步篩選。2.2根據(jù)DDBDM的大體觀察、組織學(xué)觀察、物理性能檢測(cè)、生物相容性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行DDBDM的性能評(píng)價(jià)。2.2.1 DDBDM的一般性能評(píng)價(jià)2.2.1.1觀察DDBDM的外觀、厚度、色澤、彈性情況等指標(biāo)并記錄。2.2.1.2物理性能檢測(cè)：將DDBDM進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定、降解率測(cè)定,評(píng)價(jià)其一般性能。2.2.1.3組織學(xué)檢查及評(píng)價(jià)：將DDBDM進(jìn)行HE染色,觀察膠原排列變化情況。2.2.2 DDBDM的生物相容性評(píng)價(jià)按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)之醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)方法之第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)(GB/T 16886.6-1997)進(jìn)行小鼠背部植入實(shí)驗(yàn),以ADM為對(duì)照,觀察DDBDM的纖維化和炎癥程度、材料／組織界面炎性細(xì)胞類型及其數(shù)量和分布、確定DDBDM是否存在壞死及DDBDM溶解程度、肉芽腫形成情況等。3. DDBDM與ADM細(xì)胞因子差異分析以Balb/c小鼠為研究對(duì)象,將正常皮膚、深度燒傷皮膚、ADM與DDBDM進(jìn)行細(xì)胞因子蛋白芯片實(shí)驗(yàn),研究其中308中細(xì)胞因子水平變化,并將其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,觀察燒傷及脫細(xì)胞過程對(duì)其中細(xì)胞因子變化的影響作用并分析其相關(guān)機(jī)制。結(jié)果1.恒溫恒壓電燙儀和恒溫水浴燙傷法是穩(wěn)定的可重復(fù)制作深度燒傷動(dòng)物模型的可靠方法,對(duì)于本實(shí)驗(yàn),使用恒溫水浴燙傷法能制作更穩(wěn)定及燙傷深度更均勻的深度燙傷動(dòng)物模型。2.將深度燒傷皮膚放置于0.25%胰蛋白酶-0.5% Triton X-100混合溶液中,并于37℃恒溫振蕩儀中,在一定頻率下進(jìn)行脫細(xì)胞處理后,可成功制備深度燒傷真皮基質(zhì)(DDBDM),其一般性能符合真皮替代物的基本條件。3.經(jīng)過皮下埋植實(shí)驗(yàn)證實(shí)DDBDM具有良好的生物相容性。4.經(jīng)細(xì)胞因子蛋白芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：DDBDM中比ADM無過多的有害細(xì)胞因子,其中部分細(xì)胞因子水平的變化有減少瘢痕形成,促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。結(jié)論在本研究中,DDBDM的制作方法被最終確定；將ADM和DDBDM中的細(xì)胞因子進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn),DDBDM中沒有過多的有害細(xì)胞因子,對(duì)機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生過多的損害。所以DDBDM可以成為一種理想的真皮替代物材料。如果能有一種有效方法來減少對(duì)組織有害的炎性因子,且能夠更有效的利用其中的有益細(xì)胞因子,那么可以減少其副作用,而且可以提高它的良性作用比如種子細(xì)胞的浸潤(rùn)、血管生成和細(xì)胞外基質(zhì)重建。由于DDBDM來源于自體真皮基質(zhì),異源性或異體真皮基質(zhì)的組織不相容性則不存在。然而,本實(shí)驗(yàn)有局限性,有關(guān)調(diào)節(jié)關(guān)鍵細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)未能實(shí)施,所以在體內(nèi)這些細(xì)胞因子如何發(fā)揮效應(yīng)未能得知。而且,應(yīng)用DDBDM作為真皮替代物來修復(fù)燒傷創(chuàng)面,能否加速創(chuàng)面修復(fù)也不甚明了。在以后的研究中,將針對(duì)某一具體細(xì)胞因子進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究解決這些問題。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R644

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393675