【摘要】：第一部分Ti顆粒對(duì)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1的毒性試驗(yàn)?zāi)康?驗(yàn)證所使用的Ti顆粒對(duì)成骨樣細(xì)胞的細(xì)胞毒性。明確用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)合適的Ti顆粒濃度方法 不同濃度Ti顆粒0,10,50,100,1000(Ti顆粒數(shù)/細(xì)胞數(shù);分別命名為Ti-0,Ti-10,Ti-50,Ti-100,Ti-1000組)與MC3T3-E1細(xì)胞共同培養(yǎng),48小時(shí)后觀察Ti顆粒被MC3T3-E1細(xì)胞的吞噬情況,采用CCK8試劑盒測(cè)定不同濃度Ti鈦顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。14天后,采用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié),并用氯化十六烷基吡啶進(jìn)行半定量分析。采用ALP試劑盒,測(cè)定Ti顆粒對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP分泌的影響;Real Time-PCR測(cè)定Col1α1,IL-6的表達(dá);結(jié)果 MC3T3-E1細(xì)胞與Ti顆粒共培養(yǎng)48小時(shí),可見Ti顆粒明顯被細(xì)胞吞噬。隨著Ti顆粒濃度的增加,Ti顆粒對(duì)成骨細(xì)胞的毒性逐漸增加,Ti-1000時(shí),MC3T3-E1細(xì)胞的細(xì)胞活性僅為對(duì)照組Ti-0組的28.3%;14天后茜素紅染色及半定量分析結(jié)果顯示,隨著Ti顆粒濃度的升高,MC3T3-E1細(xì)胞的礦化逐漸增加,在Ti-100達(dá)到高峰,當(dāng)Ti-1000時(shí),MC3T3-E1細(xì)胞的礦化降低。Real-Time PCR顯示Ti-100,Ti-1000均顯著抑制了MC3T3-E1細(xì)胞Col1α1的表達(dá),但Ti-1000對(duì)IL-6的表達(dá)也出現(xiàn)抑制趨勢(shì)。共培養(yǎng)7天,ALP活性結(jié)果顯示Ti-100在第7天和第14天均顯著抑制了MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性;結(jié)論 本課題選用的Ti顆粒可有效地被MC3T3-E1細(xì)胞吞噬,隨著Ti顆粒濃度的升高,Ti顆粒的毒性逐漸增加;對(duì)于細(xì)胞的分化,Ti顆粒濃度達(dá)到Ti-100時(shí),明顯抑制了成骨樣細(xì)胞的功能,但同時(shí)不至于嚴(yán)重影響細(xì)胞的活性。對(duì)于細(xì)胞的礦化,Ti顆粒并沒(méi)有抑制成骨樣細(xì)胞的礦化,反而具有促進(jìn)作用,這可能是由于細(xì)胞外未被吞噬的Ti顆粒提供的粗糙面粘附了較多的纖維蛋白導(dǎo)致,而與成骨細(xì)胞的功能和活性可能無(wú)關(guān)。第二部分低劑量X線照射對(duì)Ti顆粒刺激后MC3T3-E1細(xì)胞的影響目的 明確LDI是否會(huì)加重Ti顆粒對(duì)成骨樣細(xì)胞的影響;明確在Ti顆粒存在情況下,LDI是否能夠促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的分化;明確LDI對(duì)Ti顆粒刺激后成骨樣細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響方法 不同濃度Ti顆粒與MC3T3-E1細(xì)胞共同培養(yǎng),24小時(shí)后接受0.5 Gy X線照射,照射后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后采用CCK8試劑盒測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞的活性。照射后3天、7天后采用ELISA法測(cè)定上清液中PICP的濃度;照射后7天、14天采用ALP試劑盒測(cè)定細(xì)胞裂解液的ALP活性;照射后5天,提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,反轉(zhuǎn)錄,行Real-Time PCR對(duì)IL-6基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。照射后14天采用茜素紅染色觀察MC3T3-E1細(xì)胞的礦化并采用氯化十六烷基吡啶進(jìn)行半定量分析。結(jié)果 Ti顆粒在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的活性均有顯著地抑制效應(yīng)。照射后24小時(shí),LDI對(duì)細(xì)胞的活性沒(méi)有顯著影響,但是48小時(shí)和72小時(shí)后,LDI對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的活性也出現(xiàn)抑制效應(yīng),同時(shí)會(huì)加重Ti顆粒的影響。照射后3天,Ti-100組PICP的濃度顯著下降,在第7天時(shí)仍有明顯差異。LDI,在照射后3天對(duì)PICP濃度的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但第7天時(shí),LDI照射后,各組PICP的濃度都有升高趨勢(shì),雙因素方差分析顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALP堿性磷酸酶活性檢測(cè)顯示照射后7天,Ti顆粒因素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但照射因素對(duì)ALP活性的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。照射后14天,Ti顆粒因素對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響仍然存在,Ti顆粒各濃度組,照射后細(xì)胞的ALP活性均高于假照射組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Real-Time PCR結(jié)果顯示LDI可有效降低Ti顆粒刺激后MC3T3-E1細(xì)胞IL-6的表達(dá)。茜素紅染色顯示在Ti顆粒存在的情況下LDI仍具有促進(jìn)礦化的效應(yīng)。結(jié)論 LDI早期會(huì)加重Ti顆粒對(duì)成骨樣對(duì)細(xì)胞增殖的影響,但LDI不會(huì)加重Ti顆粒對(duì)成骨樣細(xì)胞分化的影響,反而在Ti顆粒存在的情況下仍具有促進(jìn)成骨樣細(xì)胞分化、礦化的作用,同時(shí)LDI可下調(diào)Ti顆粒刺激后成骨樣細(xì)胞IL-6的表達(dá)。第三部分低劑量X線照射與Ti顆粒對(duì)兔股骨遠(yuǎn)端植入假體骨整合的影響目的 明確LDI對(duì)兔股骨遠(yuǎn)端植入假體骨整合的影響,及對(duì)Ti顆粒注射后兔股骨遠(yuǎn)端植入假體骨整合的影響方法 將20只新西蘭白兔隨機(jī)分為照射組與對(duì)照組,每組動(dòng)物建立假體植入模型,右膝注入0.2ml生理鹽水,左膝注入0.2ml Ti顆粒懸液模擬磨損顆粒。最終動(dòng)物模型根據(jù)處理方式的不同分為四組,分別為0Gy-NS:注射生理鹽水假照射組;0Gy-Ti:注射Ti顆粒懸液假照射組;0.5Gy-NS:注射生理鹽水照射組;0.5Gy-Ti:注射Ti顆粒懸液照射組。分別于術(shù)前(0天),術(shù)后2周,4周,8周靜脈采血,行ELISA測(cè)定PINP濃度。處死前2周及4天分別注射鈣黃綠素,二甲酚橙進(jìn)行熒光標(biāo)記。術(shù)后8周處死動(dòng)物,搜集雙側(cè)股骨,行Micro-CT掃描,分析假體周圍骨小梁結(jié)構(gòu);術(shù)后8周,每組3個(gè)標(biāo)本進(jìn)行硬組織包埋,切片,熒光纖維鏡觀察并測(cè)定成骨速率,SVG染色觀察假體周圍組織結(jié)構(gòu)。Micro-CT掃描后標(biāo)本進(jìn)行生物力學(xué)壓出試驗(yàn),測(cè)定假體最大壓出力。結(jié)果 Micro-CT結(jié)果顯示LDI顯著增加了NS注射側(cè)的BV、BV/TV、Tb.N、BMD,同時(shí)使假體周圍骨小梁SIM下降,Ti顆粒僅使假體周圍DA下降,同時(shí)LDI可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。照射組與對(duì)照組,術(shù)后血清中的PINP含量均明顯升高,術(shù)后2周達(dá)到高峰,術(shù)后8周兩組均接近術(shù)前水平,但是照射組術(shù)后8周的水平仍高于術(shù)前水平,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后兩周,照射組與對(duì)照組相比,血清PINP升高更為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。硬組織切片的SVG染色可以發(fā)現(xiàn),0Gy-Ti組在假體周圍可見明顯的Ti顆粒附著,而且在Ti顆粒周圍可見明顯礦化的纖維組織,同時(shí)假體周圍可見纖維膜的形成。0.5Gy-NS組與0Gy-NS組相比較,未見明顯的異常,但0.5Gy-Ti組與0Gy-Ti組相比,發(fā)現(xiàn)雖然假體周圍也存在Ti顆粒并可見骨吸收,但是假體周圍的炎性假膜的厚度明顯變薄。熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示,0.5Gy-NS組與0Gy-NS組相比,兩條熒光標(biāo)記帶的間距明顯增寬,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;0Gy-Ti與0Gy-NS組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.5Gy-Ti組與0Gy-Ti組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,0.5Gy-Ti組與0.5Gy-NS組相比,新骨形成速率明顯下降。對(duì)各組標(biāo)本假體最大拔出力的測(cè)試結(jié)果顯示,0Gy-Ti與0Gy-NS組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;0.5Gy-NS組與0Gy-NS組相比,假體的最大壓出力顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);0.5Gy-Ti組與0Gy-Ti組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 LDI可有效通過(guò)促進(jìn)骨形成增加假體周圍骨長(zhǎng)入,提高假體的力學(xué)性能。體內(nèi)的Ti顆粒將顯著抵消LDI的促成骨作用但LDI可有效的抑制Ti顆粒引起的假體周圍炎癥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R687.4

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本文編號(hào)：2384483