【摘要】：背景現(xiàn)今全世界1/6以上的人口遭受著持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的慢性疼痛的折磨,生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。其中神經(jīng)病理性疼痛,由于病程長、病因復(fù)雜和機制不明確的因素,導(dǎo)致目前針對它的治療方法,包括神經(jīng)阻滯治療、外科治療和物理療法等均難以讓人滿意。尋找有效安全的治療方法成為研究熱點。2011年國際疼痛研究協(xié)會對神經(jīng)病理性疼痛給出新定義：神經(jīng)病理性疼痛是指軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病所引起的疼痛。脊髓背角(spinal cord dorsal horn, SCDH)作為外周神經(jīng)損傷進展為高級中樞病理改變的中間橋梁,是神經(jīng)病理性疼痛中樞致敏的關(guān)鍵因素,也一直是神經(jīng)病理性疼痛藥物治療研究的靶點。其中,神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)在脊髓背角的過度表達,是神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展機制里的重要環(huán)節(jié)。外周神經(jīng)損傷可導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元nNOS的過度表達,并伴有痛覺異常和痛覺過敏。全身或局部鞘內(nèi)注射非特異性NOS抑制劑或選擇性nNOS抑制劑,可以脊神經(jīng)結(jié)扎或緩解坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型中神經(jīng)病理性疼痛的痛敏反應(yīng)；而nNOS基因敲除鼠沒有表現(xiàn)出神經(jīng)損傷所誘導(dǎo)的機械痛敏。機體神經(jīng)受到損傷,傷害性刺激信號傳入到脊髓,產(chǎn)生過量興奮性氨基酸與NMDA受體結(jié)合,激活NMDA受體,促進Ca2+內(nèi)流從而激活nNOS。一方面通過催化L-精氨酸產(chǎn)生的一氧化氮(nitric oxide, NO),另一方面通過蛋白結(jié)構(gòu)域與NMDA受體和突觸后蛋白PSD等物質(zhì)相互作用。nNOS參與了多種神經(jīng)生理和病理過程,包括參與突觸傳遞、可塑性的調(diào)節(jié)、海馬的長時程增強、神經(jīng)元的凋亡與再生、介導(dǎo)神經(jīng)損傷和神經(jīng)變性過程[蟣。這種初級感覺神經(jīng)元的病理改變,引起初級中樞敏化和突觸重塑,最后導(dǎo)致高級中樞大腦皮層持久性功能改變。以小干擾RNA (small interference RNA, siRNA)沉默nNOS過度表達或成為治療神經(jīng)病理性疼痛的有效途徑。但由于缺乏可靠的基因載體,siRNA基因治療的臨床應(yīng)用仍然受到極大限制。近年來,細胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPPs)作為基因傳遞工具受到廣泛關(guān)注,CPPs能將siRNA等以非受體依賴的方式導(dǎo)入胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。HIV-Tat (HIV transactivator of transcription)是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子,是當(dāng)前最受矚目、研究最為深入的CPPs之一。富含堿性氨基酸的多肽片段,具有CPPs的穿膜活性,能將與之連接的基因片段高效快速地導(dǎo)入胞內(nèi),且不影響細胞的正常結(jié)構(gòu)和功能,具有轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。第49-57位(RKKRRQRRR)9個氨基酸是其發(fā)揮穿膜功能的核心序列。Alain Pluen等發(fā)現(xiàn)Tat核心序列經(jīng)膜活化多肽LK15 (KLLKLLLKLLLKLLK)修飾融合形成的細胞穿膜肽Tat-LK15,其運載siRNA轉(zhuǎn)染細胞的能力得到極大改善。因此,Tat-LK15或許可以作為一種良好的siRNA運載工具,明顯優(yōu)化RNA干擾技術(shù)在治療神經(jīng)病理性疼痛等方面的應(yīng)用。我們推測Tat-LK15可以成為神經(jīng)系統(tǒng)生物應(yīng)用的良好基因載體。目的通過探討離體條件下細胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA對神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)染效率,細胞毒性和干擾效能,為Tat-LK15作為基因載體為介導(dǎo)基因治療提供理論依據(jù)。進而探討細胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA干擾大鼠脊髓背角nNOS表達治療神經(jīng)病理性疼痛的可行性,為神經(jīng)病理性疼痛的基因治療提供新思路新策略。方法1.細胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA的轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性初步研究。根據(jù)Alain Pluen Tat-LK15序列為RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLKLLK,由廈門博欣生物生物科技有限公司合成,檢測純度為86.59%。通過與LipofectamineTM RNAiMAX(Lipo)比較,探討細胞穿透肽Tat-LK15對人腎上皮細胞(human embryonic kidney 293T cells,293T)和大鼠視神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)轉(zhuǎn)染siRNA的效率和細胞毒性。①.Tat-LK15和siRNA以質(zhì)量比為1：3、1：2、1：1、2：1、3：1混合孵育后經(jīng)20%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,通過凝膠阻滯分析測定Tat-LK15與siRNA的最佳交聯(lián)比。②.以羧基熒光素(Carboxyfluorescein,FAM)標(biāo)記的siRNA為報告基因,Tat-LK15與siRNA的質(zhì)量比分別為1:2、3:4、1:1、4:3、2:1(μg/μg),Lipo與siRNA劑量比分別為1:1、2:1、3:l、4:1v5:1(μL/μg),轉(zhuǎn)染293T和RGC-5兩種細胞。轉(zhuǎn)染24h后,倒置熒光顯微鏡檢測FAM顯色并拍照,計算轉(zhuǎn)染效率：每孔尋找3個代表性視野,各觀察100個細胞,計算陽性細胞率。并以CCK-8法檢測同等濃度下細胞存活率評估Tat-LK15細胞毒性。2.離體條件下細胞穿透肽Tat-LK1 5運載siRNA沉默RGC-5細胞神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)基因的表達。①.Tat-LK15與FAM-siRNA質(zhì)量比為3：4、1:1.2:1孵育轉(zhuǎn)染RGC-5細胞,與LipofectamineTM RNAiMAx對照,流式細胞術(shù)檢測Tat-LK15介導(dǎo)FAM-siRNA轉(zhuǎn)染效率；于6孔板中不同劑量Tat-LK15(1μg、2.5μg、5μg、10μg和20μg)孵育RGC-5細胞24 h,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。②.以缺氧缺糖(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)和高鹽(濃度145 mmol·L-1)的處理方式制備nNOS高表達的細胞模型。將RGC-5細胞隨機分為5組：對照組、模型組、Tat-S組(Tat-LK15運載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)、Lipo-S組(LipofectamineTM RNAiMAX運載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)及Tat-N組(Tat-LK15運載NCsiRNA轉(zhuǎn)染模型細胞),通過Q-PCR及Western Blot檢測各組細胞nNOS在mRNA和蛋白表達水平。3.細胞穿透肽Tat-LK15介導(dǎo)siRNA干擾大鼠脊髓背角nNOS表達治療神經(jīng)病理性疼痛。①. Tat-LK15介導(dǎo)FAM-siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠脊髓背角神經(jīng)元細胞(RN-dsc),倒置熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效果。②.健康雄性SD大鼠50只,隨機分為5組(n=10)：正常組(Control,C組)、假手術(shù)組(Sham組)、神經(jīng)病理性疼痛組(SNL組)、Tat-LK15 nNOS/siRNA組(TS組)和Tat-LK15 NCsiRNA組(TN組)。采用脊神經(jīng)結(jié)扎法(SNL)制作神經(jīng)病理性疼痛模型,C組不予任何處理,Sham組僅暴露脊神經(jīng)；SNL組、TS組、TN組構(gòu)建SNL模型同時鞘內(nèi)置管,于第7d開始每天分別鞘內(nèi)注射10μL生理鹽水、10μL含5 μg siRNA的Tat-LK15 nNOS/siRNA和Tat-LK15 NCsiRNA,持續(xù)7天。建模前1d及建模后3、7、10和14 d,用Von Frey hair觸覺測量套件測定各組大鼠50%機械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50%PWMT, g)的變化；用足底測試儀測定各組大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWTL, s);第14d測定結(jié)束后冰面上摘取L4-6節(jié)段脊髓背角,均分為兩份,存放液氮中。采用熒光定量Q-PCR方法,檢測各組大鼠脊髓背角中nNOS mRNA表達變化。采用western-blot的方法,檢測各組大鼠脊髓背角中nNOS蛋白表達的變化。結(jié)果1.①.通過凝膠阻滯分析測定Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比為2：1時,Tat-LK15可完全包裹siRNA,達到最佳交聯(lián)。②.隨著Tat-LK15和Lipo劑量的增加,siRNA轉(zhuǎn)染效率逐漸提高。與凝膠阻滯分析結(jié)果一致,當(dāng)Tat-LK15與siRNA配比為2：1 (μg/μg)時,RGC-5細胞的轉(zhuǎn)染效率達到最高[(87.3±4.5)%],但低于Lipo與siRNA配比為5:1(μg/μg)時的最高轉(zhuǎn)染效率[(96.2±3.2)%(P0.05)]；作用于293T細胞時,兩轉(zhuǎn)染試劑的最高轉(zhuǎn)染效率Tat-LK15 (2:1)轉(zhuǎn)染效率為(93.1±3.0)%與Lipo (5:1)組(98.2±1.6)%沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。轉(zhuǎn)染試劑劑量增加,Lipo細胞毒性顯著增加,而Tat-LK15毒性無明顯變化。轉(zhuǎn)染效率最高時,Lipo (5μL)組293T和RGC-5的細胞存活率僅為[(77.8±4.1)%,(73.4±7.7)%]顯著低于Tat-LK15 (2:1)組同種細胞的存活率[(91.0±3.7)%,(90.0±6.1)%](P0.05)。2.①.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明,Tat-LK15與FAM-siRNA (50 nmol·L-1)質(zhì)量比為最佳交聯(lián)比2：1(μg/μg)時,轉(zhuǎn)染效率最高(84.4±3.9)%,低于Lipo5μL的(95.6±2.4)%(P0.05)。當(dāng)Tat-LK15劑量為20 μg (6.1 μmol·L-1)時才出現(xiàn)一定細胞毒性,細胞凋亡率高于對照組[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%,P0.05]。②.經(jīng)過缺氧缺糖高鹽處理后RGC-5細胞nNOS蛋白表達顯著增高(P0.05)；單純OGD處理nNOS表達無明顯變化(P0.05)。因此,缺氧缺糖高鹽處理可以得到理想的nNOS高表達細胞模型。Tat-LK15 siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染模型細胞結(jié)果表明：與模型組相比,Tat-S組nNOS mRNA表達降低63.1%,蛋白表達降低58.9%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Tat-N組與模型組,Tat-S組與Lipo-S組nNOSmRNA及蛋白表達水平無顯著差異(P0.05)。3.①經(jīng)神經(jīng)細胞特異性物質(zhì)微管相關(guān)蛋白2(MAP2)和DAPI免疫熒光細胞化學(xué)鑒定,在熒光倒置顯微鏡下觀察大鼠脊髓背角神經(jīng)元RN-dsc細胞：結(jié)果顯示RN-dsc神經(jīng)細胞鑒定純度高；FAM-siRNA綠色熒光廣泛分布,轉(zhuǎn)染效率好。②.鞘內(nèi)注射Tat-LK15 nNOS/siRNA復(fù)合物對神經(jīng)病理性疼痛大鼠50%機械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50%PWMT, g)和大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWTL)的變化。模型制備前,5組大鼠50%PWMT和PWTL基礎(chǔ)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與假手術(shù)Sham組比較,造模后的SNL組、TN組和TS組在模型之后3～7 d 50% PWMT減少(P0.01), PWTL縮短(P0.01)；正常組C組50%PWMT和PWTL差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后7d開始鞘內(nèi)給藥后,與神經(jīng)病理性疼痛模型SNL組比較,鞘內(nèi)注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS組在10～14 d50%PWMT增加(P0.01),PWTL延長(P0.01)；而鞘內(nèi)注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN組50%PWMT (P0.05), PWTL (P0.05)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Tat-LK15-nNOS siRNA復(fù)合物對神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角nNOS表達的影響。與假手術(shù)Sham組比較,制備模型后SNL組脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表達上調(diào)(P0.01),正常大鼠C組脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。鞘內(nèi)給藥后,與神經(jīng)病理性疼痛組SNL組比較,鞘內(nèi)注射Tat-LK15-nNOS siRNA的TS組大鼠脊髓背角nNOS mRNA及其蛋白表達顯著降低(P0.01)；而鞘內(nèi)注射Tat-LK15-NCsiRNA的TN組大鼠脊髓背角nNOSmRNA及其蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.離體條件下,細胞穿透肽Tat-LK15可以成功介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染多種細胞,Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比2：1為最佳交聯(lián)比,具有良好的轉(zhuǎn)染效率。細胞毒性極低,安全優(yōu)勢突出。細胞穿透肽Tat-LK15可成功介導(dǎo)nNOS siRNA轉(zhuǎn)染RGC-5神經(jīng)細胞并干擾nNOS的過度表達,所以Tat-LK15可以作為運載siRNA干擾神經(jīng)細胞nNOS表達的有效工具。并且Tat-LK15可高效介導(dǎo)nNOS siRNA轉(zhuǎn)染原代大鼠脊髓背角神經(jīng)元細胞。2.SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠50%機械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50%PWMT,g)和大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWTL)均明顯降低；鞘內(nèi)注射Tat-LK15-nNOS siRNA復(fù)合物,可顯著抑制SNL神經(jīng)病理性疼痛大鼠的50%機械性刺激縮足反應(yīng)閾值(50%PWMT, g)和大鼠熱刺激縮足潛伏期(PWTL)的降低；神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS mRNA水平及蛋白水平的表達顯著升高；鞘內(nèi)注射Tat-LK15 nNOS/siRNA復(fù)合物,可明顯抑制神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS mRNA水平及蛋白水平的升高。3.上述結(jié)果表明：在體條件下細胞穿透肽Tat-LK15可成功介導(dǎo)nNOS siRNA干擾神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角nNOS的過度表達。從而緩解神經(jīng)病理性疼痛大鼠的痛覺過敏,對神經(jīng)病理性疼痛具有治療作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R614

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本文編號：2251278