【摘要】：目的:建立兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)采用全骨髓法體外分離,檢測其生物學特性和多向誘導分化特征,并觀察其對細胞形態(tài)和增殖性能的影響。制備透明質(zhì)酸水凝膠,檢測其生物相容性和抗降解能力。通過構(gòu)建兔股骨中下段缺損模型,以濃縮骨髓血液、HA冷凍解凍水凝膠和異體骨條作為內(nèi)植物修復兔骨缺損,探討生物水凝膠體系修復兔股骨中下段缺損的效果。方法:(1)采用全骨髓貼壁細胞分離法提取純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞,用含10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)BMSCs;(2)采用流式細胞儀檢測細胞表面特異性受體表達,進行鑒定,并且在不同誘導培養(yǎng)基的作用下向成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞分化,采用特異性染色并觀察其結(jié)果;(3)采用冷凍解凍成膠的方法制備透明質(zhì)酸(HA)水凝膠,將BMSCs種植于HA水凝膠后通過觀察其中的細胞形態(tài)分布來檢測HA水凝膠的生物相容性,采用體外降解和動物體內(nèi)包埋的方式檢測其抗降解能力;(4)實驗動物40只,其中4只分為2組作為造模位置選擇的研究,分別在右側(cè)橈骨和股骨中下段造成相同面積的缺損,其余36只隨機分為4組,建立股骨缺損創(chuàng)傷模型;濃縮骨髓血液和制備HA水凝膠備用;A組植入生物水凝膠體系,B組植入異體骨-HA水凝膠復合物,C組單純植入異體骨,D組植入自體髂骨。術(shù)后通過X線和大體標本骨檢測修復效果,并且將修復區(qū)制作切片和HE染色觀察微觀成骨效果。結(jié)果:(1)體外培養(yǎng)的原代BMSCs接種1d開始貼壁,形態(tài)呈長梭形或類圓形;8d-9d后可首次傳代;(2)獲得的細胞高表達間充質(zhì)干細胞的表面抗原CD29、CD44、CD90,不表達CD45、CD34,證明為間充質(zhì)干細胞;(3)BMSCs在三種誘導液的誘導下,經(jīng)過21d的增殖分化,分別可被茜素紅、番紅O和油紅O染色,證明獲得三種成體細胞;(4)造模動物一月后X線顯示兔股骨中下段自身的修復能力更弱,適合造模;(5)內(nèi)置材料的動物術(shù)后X線結(jié)果顯示:4weeks A組缺損面積減小,24weeks A組和D組完整修復骨缺損,B、C兩組骨修復區(qū)與正常骨骨質(zhì)界限清晰,修復面積未達到完整結(jié)果;大體標本觀察結(jié)果與X線結(jié)果一致;切片HE染色顯示4weeks時A、B、D三組觀察到缺損區(qū)單側(cè)骨膜形成,8weeks只有A組具備完整性內(nèi)外骨膜連續(xù)性的動物,A、D組優(yōu)于B、C組,24weeks A、D組修復區(qū)與正常骨質(zhì)無差別,未見與正常骨質(zhì)界限,而B、C組則修復較差。結(jié)論:應用全骨髓貼壁法可以獲得純度較高、增殖能力強、表型穩(wěn)定均一、具備多向分化的能力的BMSCs;冷凍解凍成膠法制備的透明質(zhì)酸水凝膠可作為一種無細胞毒性的三維細胞支架材料,具備一定的抗降解能力;股骨中下段可作為骨缺損造模的選擇,濃縮骨髓-HA水凝膠-異體骨合成的生物水凝膠體系對于骨缺損的修復有積極作用,可促進早期組織再生和血管再通,是一項臨床應用潛力的新技術(shù)。
[Abstract]:Aim: to establish rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) isolated by whole bone marrow method in vitro, to detect the biological characteristics and multidirectional differentiation characteristics, and to observe its effects on the morphology and proliferation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Hyaluronic acid hydrogel was prepared and its biocompatibility and anti-degradation ability were tested. A rabbit model of middle and lower femur defect was established. The bone defects were repaired with concentrated bone marrow hemoglobin freezing and thawing hydrogel and allogeneic bone strips as implants, and the effect of biological hydrogel system on repairing rabbit femur middle and lower segment defect was discussed. Methods: (1) Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) were isolated and purified by whole bone marrow adherent cells. BMSCs were cultured in 10% fetal bovine serum culture medium. (2) the expression of specific receptors on cell surface was detected by flow cytometry. In addition, osteoblasts, chondroblasts and adipocytes were differentiated into osteoblasts, chondroblasts and adipocytes in different culture medium. (3) Hyaluronic acid (HA) hydrogel was prepared by freezing and thawing gelation. The biocompatibility of HA hydrogels was detected by observing the morphological distribution of HA hydrogels, and the anti-degradation ability of HA hydrogels was tested by in vitro degradation and in vivo embedding of BMSCs. (4) 40 experimental animals were used to study the biocompatibility of HA hydrogels. Four of them were divided into 2 groups to select the location of the model. The same area of defect was created in the right radius and the middle and lower femur, and the other 36 were randomly divided into 4 groups to establish the model of femoral defect trauma. Bone marrow blood was concentrated and HA hydrogel was prepared. Group A was implanted with biological hydrogel system. Group B was implanted with allogeneic bone and HA hydrogel complex. Group C was implanted with allogeneic bone only. Group D was implanted with autogenous iliac bone. The effect of bone repair was detected by X-ray and gross bone after operation, and the microscopic osteogenic effect was observed by making sections of repair area and HE staining. Results: (1) the primary BMSCs inoculated in vitro began to adhere to the wall 1 day after inoculation. (2) the surface antigen CD29, CD44, CD90, not CD45, CD34, was proved to be mesenchymal stem cells. (3) BMSCs was induced by three kinds of inducers and differentiated after 21 days. It was proved that three kinds of adult cells were obtained by alizarin red, phannin O and oil red O, respectively. (4) X-ray showed that the repair ability of rabbit femur was weaker after 1 month. The results of X-ray showed that the defect area of group A and group D were reduced and the boundary between bone repair area and normal bone in group A and group D were clear, and the area of repair was not up to the complete result. The results were as follows: (1) the results of X-ray showed that the defect area of group A was less than that of group A, and that of group B (group D) was significantly lower than that of group B (P < 0.05). The results of gross specimen observation were consistent with those of X-ray. Section HE staining showed that only A group A with complete internal and external periosteum continuity was found to have no difference between the repair area and the normal bone in group A and B C group during 4weeks, and there was no significant difference between the repair area and the normal bone in the group A and B C, and there was no difference between group A and B C, and no difference was found between the repair area and the normal bone in the group A and B C, and there was no significant difference between the repair area and the normal bone in group A. In group C, the repair was poor. Conclusion: the whole bone marrow adherent method can obtain high purity, strong proliferative ability, stable and uniform phenotype. BMSCs with multi-differentiation ability; hyaluronic acid hydrogel prepared by freezing and thawing gelation method can be used as a non-cytotoxic three-dimensional cell scaffold material with certain anti-degradation ability; the middle and lower femur can be used as a choice for modeling bone defect. The biomedical hydrogel system which concentrates bone marrow hydrogel and allograft bone synthesis has a positive effect on the repair of bone defect and can promote early tissue regeneration and vascular recanalization. It is a potential new technique for clinical application.
【學位授予單位】：寧波大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R68

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本文編號：2182102