【摘要】：目的 :觀察缺氧和營養(yǎng)缺乏對(duì)軟骨終板干細(xì)胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)凋亡的影響,探討B(tài)細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19-k Da結(jié)合蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3,BNIP3)信號(hào)通路在其中的作用。方法 :從臨床獲取退變椎間盤軟骨終板標(biāo)本,分離培養(yǎng)軟骨終板細(xì)胞,使用瓊脂糖篩選獲得CESCs并進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定,將第三代細(xì)胞分別在常氧/完全培養(yǎng)基(對(duì)照組)與缺氧和營養(yǎng)缺乏(實(shí)驗(yàn)組)條件下培養(yǎng)48h,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性,Western Blot檢測(cè)BNIP3、Bcl-2關(guān)聯(lián)x蛋白(Bax)、Bcl-2關(guān)聯(lián)k蛋白(Bak)和低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)蛋白表達(dá)水平。使用BNIP3小干擾RNA(siRNA)干擾CESCs中BNIP3基因,同時(shí)設(shè)置陰性干擾對(duì)照組(Scramble siRNA),同前分組處理后再次檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活性及BNIP3、Bax、Bak蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:對(duì)5例標(biāo)本獲得的CESCs進(jìn)行了干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定,其中細(xì)胞表面粘附分子44(CD44)、CD73、CD90和CD105為陽性,CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR為陰性,提示CESCs具有干細(xì)胞特性。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為(29.12±0.65)%顯著高于對(duì)照組的(14.87±2.03)%(P0.05);實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖活性明顯降低,為對(duì)照組的56.18%(P0.05)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組BNIP3、Bax、Bak蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05)。使用BNIP3 siRNA干擾后,缺氧和營養(yǎng)缺乏引起的細(xì)胞凋亡增加和細(xì)胞增殖活力下降均被明顯抑制;同時(shí),缺氧和營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致CESCs中BNIP3、Bax和Bak的蛋白表達(dá)升高也被顯著逆轉(zhuǎn)(P0.05)。結(jié)論:缺氧和營養(yǎng)缺乏能夠誘導(dǎo)CESCs發(fā)生凋亡,此過程可能是通過上調(diào)BNIP3、Bax和Bak蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用的。
[Abstract]:Aim: to investigate the effects of hypoxia and nutritional deficiency on apoptosis of cartilage endplate-derived stem cells in vitro, and to investigate the role of Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3 (BNIP3) signaling pathway in B-cell lymphoma / leukemia / adenovirus E1B 19-k Da binding protein 3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3). Methods: the specimens of degenerative intervertebral disc cartilage endplate were obtained from clinic, the chondrocytes were isolated and cultured, CESCs was obtained by agarose screening, and stem cell markers were identified. The third generation cells were cultured in normoxic / complete medium (control group) and hypoxia and nutrition deficiency (experimental group) for 48h respectively. The apoptosis rate was detected by flow cytometry and the cell activity was detected by CCK-8 method. Western Blot was used to detect BNIP3Bcl 2 association. The expression levels of (Bak) and HIF-1 偽 protein associated with Bcl-2 in x protein (Bax) were detected. BNIP3 small interference RNA (siRNA) was used to interfere BNIP3 gene in CESCs, and the negative interference control group (Scramble siRNA),) was used to detect the apoptosis rate, cell activity and the expression level of BNIP3 Bax-Bak protein. Results: stem cell markers were identified in 5 cases of CESCs. The results showed that the cell surface adhesion molecule 44 (CD44) CD73 CD90 and CD105 were positive for CD34, CD45, CD11, CD19 and HLA-DR, indicating that CESCs had stem cell characteristics. The apoptosis rate of experimental group (29.12 鹵0.65)% was significantly higher than that of control group (14.87 鹵2.03)% (P0.05), and the proliferative activity of experimental group was significantly lower than that of control group (56.18%, P0.05). Compared with the control group, the expression of BNIP3 was significantly up-regulated in the experimental group (P0.05). The increase of apoptosis and the decrease of cell proliferation activity induced by hypoxia and nutrition deficiency were significantly inhibited after BNIP3 siRNA interference, and the increase of protein expression of BNIP3, Bax and Bak in CESCs was also significantly reversed by hypoxia and nutritional deficiency (P0.05). Conclusion: hypoxia and nutritional deficiency can induce apoptosis of CESCs, which may be mediated by up-regulating the expression of BNIP3, Bax and Bak proteins.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院骨科;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81272028)
【分類號(hào)】：R681.5

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本文編號(hào)：2178033