本文選題：松果菊苷 + BMSCs　； 參考：《遼寧中醫(yī)藥大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：目 的：本研究以中醫(yī)理論“腎主骨”為依據(jù),從成骨分化的BMP2-Smad-Runx2信號途徑出發(fā),采用細(xì)胞培養(yǎng)、Elisa檢測、免疫熒光細(xì)胞染色法、Western blot和RT-PCR等多種技術(shù)方法,觀察補腎中藥肉蓯蓉(傳統(tǒng)補腎中藥)中的活性成分松果菊苷含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨細(xì)胞分化的作用,并從細(xì)胞及分子水平揭示松果菊苷含藥血清發(fā)揮誘導(dǎo)作用的機制,為骨組織工程的種子細(xì)胞的來源提供一種新的誘導(dǎo)劑,為BMSCs在組織工程及骨折愈合及骨缺損修復(fù)方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)及相關(guān)依據(jù),也為松果菊苷的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一個新的思路。材料與方法：第一部分：松果菊苷促進(jìn)BMSCs增殖的研究。1.制備松果菊苷含藥血清。取60只SPF級SD大鼠,采用隨機數(shù)字表法分為正常組和松果菊苷(Echinacoside,ECH)組。松果菊苷組給予松果菊苷水溶液(松果菊苷的濃度為4mg/ml,每只大鼠每次灌胃lml)灌胃,正常對照組給予等體積的生理鹽水,兩組每日均灌胃2次,連續(xù)4d。末次灌胃后用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉,用負(fù)壓采血管從腹主動脈采血,室溫下使血液自然凝固,離心后分離出血清,經(jīng)56℃水浴滅活30min,過濾除菌后分裝到無菌的離心管中,-80℃冰箱保存。2. BMSCs的分離培養(yǎng)。采用全骨髓貼壁篩選方法進(jìn)行原代BMSCs的分離,在37℃,含5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后第3d在倒置顯微鏡下觀察,見細(xì)胞貼壁后半量換液,以后每2d換液1次。原代培養(yǎng)14d時細(xì)胞融合達(dá)80%,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。3. BMSCs的鑒定。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,接種在置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)4d。免疫熒光檢測CD29、CD34、CD44的表達(dá)。4.松果菊苷對BMSCs增殖的影響。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/ml,接種于7塊96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)板邊緣孔用無菌PBS填充,其余每孔加入100 u 1細(xì)胞懸液,置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后第2d,按照實驗分組,正常對照組、陽性對照組、不同濃度松果菊苷含藥血清組(2.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%含藥血清)更換相應(yīng)的培養(yǎng)基,每組設(shè)6個復(fù)孔,每日上午相同時間更換培養(yǎng)基,共培養(yǎng)7d。每天取1塊培養(yǎng)板,每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)培養(yǎng)4h后吸去培養(yǎng)基,每孔加入DMSO低速震蕩l0min,檢測各孔490nm的吸光度。第二部分：松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的研究。1.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,堿性磷酸酶染色檢測。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,接種在置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第2d按實驗分組(同第一部分)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔。每2d更換培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)7d,用4%多聚甲醛固定30min,并加入新鮮配置的底物應(yīng)用液,37℃下避光孵育,15min后蒸餾水沖洗,鏡下觀察。2.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,堿性磷酸酶含量檢測。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL,接種于24孔培養(yǎng)板,第2d按實驗分組(同第一部分)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔。每2d換培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)7d。第8d棄去培養(yǎng)基用PBS洗細(xì)胞2次,每孔加入細(xì)胞裂解液(RIPA)50μl,使細(xì)胞充分裂解。將樣本轉(zhuǎn)移到EP管中,超聲粉碎,3000rpm離心20min,收集上清于-20℃保存?zhèn)溆�。按ELISA試劑盒說明操作,測定各樣本ALP含量。3.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,骨鈣素的免疫熒光細(xì)胞染色檢測。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,接種在置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),第2d按實驗分組(同第一部分)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔,每2d更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)14d。免疫熒光檢測骨鈣素表達(dá)。4.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,骨鈣素含量的檢測。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104／mL,接種于24孔培養(yǎng)板,第2d按實驗分組(同第一部分)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔。每2d換培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)14d。第15d取細(xì)胞裂解液,按ELISA試劑盒說明操作,測定各樣本BGP含量。5.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,Ⅰ型膠原的免疫熒光細(xì)胞染色檢測。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,接種在置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第2d按實驗分組(同第一部分)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔,每2d更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)7d。免疫熒光檢測Ⅰ型膠原表達(dá)。6.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,礦化結(jié)節(jié)檢測。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×10-/mL,接種于24孔培養(yǎng)板,CO,培養(yǎng)箱培養(yǎng),第2d按實驗分組(同第一部分)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔。每2d換培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)21d。棄去培養(yǎng)基,4%多聚甲醛固定30 min,PBS沖洗3次,用0.1%茜素紅S染色液(pH8.3)在37℃下染色30min,PBS沖洗數(shù)次,自然干燥,鏡下觀察。第三部分：松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化機制的研究。1.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,BMP2表達(dá)的檢測。取P3代BMSCs,接種在置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第2d按實驗分組(正常對照組、陽性對照組、松果菊苷組)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔,每2d更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)7d。采用免疫熒光細(xì)胞染色、Western blot、RT-PCR檢測BMP2表達(dá)。2.BMP2抑制劑Noggin對松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時,堿性磷酸酶含量的影響。取對數(shù)生長期的P3代BMSCs,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL,接種于24孔培養(yǎng)板,第2d按實驗分組(正常對照組、陽性對照組、松果菊苷組、抑制劑Noggin組)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔。每2d換培養(yǎng)基,連續(xù)培養(yǎng)7d。第8d裂解細(xì)胞,收集樣本于-20℃保存?zhèn)溆谩０碋LISA試劑盒說明操作,測定各樣本ALP含量。3.BMP2抑制劑Noggin對松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化時Smadl/5/8、ZHX3、Runx2和OSX表達(dá)的影響。取P3代BMSCs,接種在置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第2d按實驗分組(正常對照組、陽性對照組、松果菊苷組、抑制劑Noggin組)更換不同培養(yǎng)基,每組設(shè)3個復(fù)孔,每2d更換培養(yǎng)基。采用免疫熒光細(xì)胞染色、Western blot、RT-PCR檢測Smad1/5/8、ZHX3、Runx2和OSXmRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：1.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs的形態(tài)特征觀察。原代培養(yǎng)第1d,貼壁細(xì)胞較少,形狀近似圓形。培養(yǎng)第2-3d出現(xiàn)長梭形貼壁細(xì)胞,數(shù)目逐漸增多,細(xì)胞形態(tài)逐漸變長。培養(yǎng)第5d可見貼壁的梭形細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多,開始形成分散的小集落,呈菊花樣生長。培養(yǎng)第10d細(xì)胞集落逐漸增多增大,集落中心的細(xì)胞密度較大,細(xì)胞體積相對較小,集落周邊細(xì)胞分布稀疏,呈放射狀分布,細(xì)胞集落大小不一,集落彼此出現(xiàn)融合。培養(yǎng)14d左右,細(xì)胞融合度接近80%,用胰酶消化后,傳代培養(yǎng),傳代后的細(xì)胞形態(tài)逐漸均一,P3代BMSCs表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞特征,呈梭形,融合后表現(xiàn)為極性、旋渦狀生長。2.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的細(xì)胞鑒定。免疫熒光細(xì)胞染色法檢測細(xì)胞表面的CD29、CD34、CD44的表達(dá),其中CD29和CD44表達(dá)為陽性,CD34不表達(dá),表明用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有BMSCs特征。3.松果菊苷對BMSCs增殖的影響。用不同濃度松果菊苷含藥血清培養(yǎng)BMSCs,進(jìn)行MTT檢測。同一時間點與正常對照組比較,2.5%松果菊苷含藥血清沒有促進(jìn)BMSCs增殖的作用,差異無顯著性(P005),5%、7.5%、10%、15%松果菊苷含藥血清能明顯促進(jìn)BMSCs細(xì)胞增殖,有顯著性差異(P0.05),其中15%松果菊苷含藥血清的促增殖作用最強,有極顯著性差異(P0.01)。當(dāng)給藥濃度過高時,如20%松果菊苷含藥血清組對BMSCs的增殖無促進(jìn)作用。從促進(jìn)細(xì)胞增殖的角度考慮5%、7.5%、10%、15%松果菊苷含藥血清的效果較好。4.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中ALP的變化。按不同處理因素培養(yǎng)細(xì)胞7d后,ELISA檢測細(xì)胞裂解上清液中ALP含量的變化,與正常對照組比較,陽性對照組及7.5%、10%、15%松果菊苷含藥血清組的ALP表達(dá)明顯升高,差異有顯著性(P0.05)。與陽性對照組相比,7.5%及10%松果菊苷含藥血清組的ALP的表達(dá)明顯增高,有極顯著性差異(P0.01)。ALP染色結(jié)果顯示,正常對照組和2.5%松果菊苷含藥血清組細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒較少,兩組無顯著性差異(P0.05)；與正常對照組相比,陽性對照組與7.5%、10%、15%松果菊苷含藥血清組細(xì)胞內(nèi)棕黃色顆粒明顯增加,有極顯著性差異(P0.01)； 10%松果菊苷含藥血清組的ALP的表達(dá)與陽性對照組相比,有顯著性差異(P0.05)；而20%松果菊苷含藥血清組ALP表達(dá)雖略有增高,但與陽性對照組比無顯著性差異(P005)。5.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中BGP的變化。按不同處理因素培養(yǎng)細(xì)胞14d后,ELISA檢測細(xì)胞裂解上清液中BGP含量的變化,與正常對照組比較,陽性對照組及10%松果菊苷含藥血清組的BGP表達(dá)明顯升高,差異有顯著性(P-0.05)。與陽性對照組比較,10%松果菊苷含藥血清組的BGP的表達(dá)增高,有顯著性差異(P0.05)。免疫熒光細(xì)胞染色檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,陽性對照組與10%松果菊苷含藥血清組細(xì)胞的BGP表達(dá),有顯著性差異(P0.01)；10%松果菊苷含藥血清組的BGP的表達(dá)與陽性對照組相比,有顯著性差異(P0.05)。6.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中Ⅰ型膠原的變化。按不同處理因素培養(yǎng)細(xì)胞7d后,免疫熒光細(xì)胞染色檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,陽性對照組與10%松果菊苷含藥血清組細(xì)胞的Ⅰ型膠原表達(dá)增多,有極顯著性差異(P0.01)；10%松果菊苷含藥血清組的Ⅰ型膠原的表達(dá)與陽性對照組相比,有顯著性差異(P0,05)。7.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中礦化結(jié)節(jié)的檢測。按不同處理因素培養(yǎng)細(xì)胞21d后,茜素紅染色檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,陽性對照組與10%松果菊苷含藥血清組細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多,有極顯著性差異(P0.01)； 10%松果菊苷含藥血清組的礦化結(jié)節(jié)與陽性對照組相比,有顯著性差異(P0.05)。8.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中BMP2表達(dá)的檢測。與正常對照組相比,陽性對照組、松果菊苷組BMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01)；與陽性對照組相比,松果菊苷組的BMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高,有極顯著性差異(P0.0.01)。9.抑制劑Noggin對松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中ALP的影響。按不同處理因素培養(yǎng)細(xì)胞7d后,ELISA檢測細(xì)胞裂解上清液中ALP含量的變化,與正常照組比較,陽性對照組、松果菊苷組及抑制劑Noggin組的ALP含量明顯升高,差異有顯著性(P0.05)。與陽性對照組相比,松果菊苷組的ALP含量明顯增高,有極顯著性差異(P0.01),使用抑制劑Noggin后,ALP含量下降,有顯著性差異(P0.05)。10.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中Smadl/5/8表達(dá)的檢測。與正常對照組相比,陽性對照組、松果菊苷組及抑制劑Noggin組的Smadl/5/8 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01)；與陽性對照組相比,松果菊苷組的Smadl/5/8 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01),抑制劑Noggin組的Smadl/5/8 mRNA和蛋白的表達(dá)降低,有極顯著性差異(P0.01)。11.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中ZHX。表達(dá)的檢測。與正常對照組相比,陽性對照組、松果菊苷組及抑制劑Noggin組的ZHX3 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01)；與陽性對照組相比,松果菊苷組的ZHX3 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01),抑制劑Noggin組的ZHX3 mRNA和蛋白的表達(dá)降低,有極顯著性差異(P0.01)。12.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中Runx2表達(dá)的檢測。與正常對照組相比,陽性對照組、松果菊苷組及抑制劑Noggin組的Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01)；與陽性對照組相比,松果菊苷組的Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01),抑制劑Noggin組的Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)降低,有極顯著性差異(P0.01)。13.松果菊苷誘導(dǎo)BMSCs成骨分化過程中OSX表達(dá)的檢測。與正常對照組相比,陽性對照組、松果菊苷組及抑制劑Noggin組的OSX mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01)；與陽性對照組相比,松果菊苷組的OSX mRNA和蛋白的表達(dá)升高,有極顯著性差異(P0.01),抑制劑Noggin組的OSX mRNA和蛋白的表達(dá)降低,有極顯著性差異(P0.01)。結(jié) 論：1.在一定濃度范圍內(nèi)的松果菊苷含藥血清(5%、7.5%、10%、15%含藥血清)可以促進(jìn)BMSCs增殖,存在濃度依賴性。濃度過低(2.5%)或者濃度過高(20%)對BMSCs增殖無促進(jìn)作用。2.松果菊苷含藥血清能夠使BMSCs的ALP、BGP、I型膠原的表達(dá)增多,促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成,提示松果菊苷含藥血清具有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力,其中10%松果菊苷含藥血清的效果最佳。3.松果菊苷含藥血清能顯著促進(jìn)BMSCs中BMP2、Smad1/5/8、ZHX3、Runx2和OSX mRNA和蛋白表達(dá)。提示松果菊苷可能通過BMP2-Smad-Runx2通路發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用。
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【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R68

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2083884