發(fā)布時間：2018-06-18 09:47

  本文選題：皮瓣 + 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞　； 參考：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:通過體外對人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,h AMSCs)的分離、培養(yǎng)及鑒定,并在體外誘導(dǎo)分化為雪旺氏細(xì)胞樣細(xì)胞(induce Schwann cells,i SCs),分別觀察兩種細(xì)胞移植對皮瓣神經(jīng)再生的影響。方法:1)產(chǎn)婦知情同意后采集足月剖宮產(chǎn)羊膜,采用胰蛋白酶/膠原酶二步消化法分離提取h AMSCs,接種48h后予以細(xì)胞換液以去除人羊膜上皮細(xì)胞,并按同樣方法傳1~2代,通過差速貼壁方法純化h AMSCs。流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光鑒定h AMSCs。2)取P3代生長至第6d的h AMSCs在體外誘導(dǎo)分化為i SCs,誘導(dǎo)分化后,分別取i SCs和P3代h AMSCs做免疫熒光染色檢測兩組細(xì)胞S-100、P75和GFAP的表達(dá);Western blot檢測兩組細(xì)胞S-100、P75和GFAP蛋白的表達(dá);實時熒光定量PCR檢測兩組細(xì)胞S-100、P75和GFAP基因表達(dá);ELISA檢測h AMSCs培養(yǎng)6d以及h AMSCs誘導(dǎo)后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF濃度。3)建立大鼠腹壁失神經(jīng)支配穿支皮瓣模型,分為三組:即h AMSCs移植組(A組)、i SCs移植組(B組)及穿支皮瓣模型對照組(C組),每組25只。取增殖期的P3代h AMSCs和誘導(dǎo)后的i SCs,分別于每只大鼠皮瓣標(biāo)記處皮下多點注射1×106個相應(yīng)細(xì)胞,C組注射PBS。免疫熒光染色觀察神經(jīng)再生,分別于細(xì)胞移植后2d、5d、7d、9d、14d各組取5只動物。結(jié)果:1)本實驗中采用胰蛋白酶/膠原酶雙酶化法可以獲得大量增殖穩(wěn)定的h AMSCs,并利用差速貼壁法可去除大量的人羊膜上皮細(xì)胞,獲得純度較高的h AMSCs。h AMSCs原代培養(yǎng)48h后可見細(xì)胞貼壁生長,5~6d細(xì)胞密度可達(dá)到80%~90%。流式細(xì)胞鑒定:CD90(99.61%)、CD44(99.64%)、CD73(99.82%)、CD105(91.84%)呈陽性,CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR呈陰性(0.12%)。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示h AMSCs高表達(dá)波形蛋白,未表達(dá)CK19。2)免疫熒光染色結(jié)果顯示i SCs組S-100、P75和GFAP的表達(dá)量明顯高于h AMSCs組(P0.05);Western blot結(jié)果顯示i SCs組S-100、P75和GFAP蛋白表達(dá)量明顯高于h AMSCs組(P0.05);q PCR結(jié)果顯示i SCs組S-100、P75和GFAP的基因表達(dá)量明顯高于h AMSCs組(P0.05);ELISA分別檢測h AMSCs培養(yǎng)6d以及h AMSCs誘導(dǎo)后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF濃度:可見h AMSCs培養(yǎng)6天后BDNF和NGF均有表達(dá),加入誘導(dǎo)液1后,BDNF和NGF表達(dá)量明顯降低,隨著誘導(dǎo)液2及誘導(dǎo)液3的依次添加,BDNF和NGF的表達(dá)量逐漸升高,且濃度明顯高于h AMSCs培養(yǎng)6d組,說明在誘導(dǎo)分化過程中分泌了大量的BDNF和NGF,提供了潛在的促進(jìn)神經(jīng)再生的營養(yǎng)支持。3)細(xì)胞移植后第2d、5d、7d、9d、14d分別行皮瓣組織免疫熒光染色,i SCs移植組再生神經(jīng)纖維數(shù)量和直徑均高于h AMSCs移植組。結(jié)論:1)胰蛋白酶/膠原酶雙酶消化法可獲得大量的hAMSCs,通過胰酶消化和差速貼壁法,可獲得高純度的h AMSCs;2)分別通過免疫熒光、Western blot、q PCR及ELISA等方法的鑒定,證明了h AMSCs在體外經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)因子調(diào)節(jié)后可誘導(dǎo)分化為雪旺氏細(xì)胞樣細(xì)胞,且在誘導(dǎo)分化過程中釋放了大量的促進(jìn)神經(jīng)生長的因子;3)h AMSCs和i SCs分別移植到失神經(jīng)支配的皮瓣模型后均可觀察到神經(jīng)的再生,i SCs通過釋放大量的BDNF和NGF,在神經(jīng)再生數(shù)量和直徑方面均高于h AMSCs。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of two kinds of cell transplantation on the nerve regeneration of skin flap by means of two - step digestion with trypsin / collagenase . The expression of S - 100 , P75 and GFAP in human amniotic membrane was detected by means of two - step digestion method . The results showed that the expression of S - 100 , P75 and GFAP was significantly higher than that in h - AMSCs ( P0.05 ) . Results : 1 ) The expression of BDNF and NGF was significantly lower than that of h - AMSCs . Conclusion : 1 ) The number and diameter of BDNF and NGF in vitro were significantly higher than that of h - AMSCs . Conclusion : 1 ) The number and diameter of regenerated nerve fibers were higher than that of h - AMSCs .
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R622

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本文編號：2035050