本文選題：TRAIL + U2OS細胞�。� 參考：《昆明理工大學》2015年碩士論文

【摘要】：腫瘤凋亡因子TRAIL是TNF家族的成員之一,其不論在體內還是體外均可選擇性的誘導癌細胞凋亡,初期臨床試驗已經證實TRAIL或死亡受體激動劑抗體在癌癥治療中的安全性。另外,也有研究表明許多癌細胞對TRAIL有耐受性,究其原因是凋亡通路中抗凋亡蛋白c-FLIP和IAPs等的阻遏。近來研究發(fā)現(xiàn),siRNA靶向抑制c-FLIP的同時結合廣譜IAP拮抗劑AT406進一步提高了TRAIL誘導的癌細胞凋亡,因此聯(lián)合使用c-FLIP抑制劑或拮抗劑、IAP拮抗劑以及TRAIL或死亡受體激動劑抗體這三類藥物可能是理想的抗癌新方法。骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,主要發(fā)生在青少年患者中,它是一種快速生長且容易轉移的腫瘤。骨肉瘤的形成和發(fā)展機制已經研究了很長一段時間,最近,更多的研究證據(jù)表明,c-FLIP在調節(jié)腫瘤生長中扮演著重要角色。因此,為了利用RNAi技術來研究c-FLIP在TRAIL誘導的U20S細胞凋亡中的作用,我們進行了如下實驗：目的：建立穩(wěn)定下調c-FLIP表達的骨肉瘤U20S細胞系,了解惡性腫瘤細胞產生耐藥的生物特性和耐藥機制。方法：通過構建產生siRNA的質粒pSUPER-c-FLIP-siRNA,并將該質粒和空載轉染入骨肉瘤U20S細胞系,加入含終濃度為1μg/ml的Puromycin的DMEM培養(yǎng)基篩選6天,加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)擴大培養(yǎng),待細胞密度達到50%時,繼續(xù)加入維持濃度0.25μg/ml的Puromycin繼續(xù)培養(yǎng),至篩選出穩(wěn)定下調c-FLIP表達的克隆細胞并擴大培養(yǎng)。篩選過程中用普通光學顯微鏡觀察細胞死亡和生長狀況。分別應用Western Blot和半定量RT-PCR方法比較實驗組克隆細胞和對照組轉染空載的克隆細胞系中c-FLIP蛋白和mRNA水平上的差異。利用MTT方法,檢測克隆細胞系U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA和對照組U2OS/pSUPER的細胞凋亡率,c-FLIP抑制劑rocaglamide預處理4h或沒有預處理并結合IAPs抑制劑AT406和TRAIL作用24小時,進一步檢驗細胞凋亡,并繪制細胞的存活率曲線。最后,流式細胞術檢測細胞凋亡全過程,利用SPSSvl9軟件進行統(tǒng)計分析。結果：我們構建了pSUPER-c-FLIP-siRNA質粒,然后轉染入U20S細胞,之后從這些轉染細胞中篩選得到了穩(wěn)定轉染的細胞株U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA和U20S/pSUPER。半定量RT-PCR和Western Blot結果顯示,與對照細胞U2OS/pSUPER相比,克隆細胞U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA的c-FLIP表達被c-FLIP-siRNA顯著抑制。同時,MTT檢測結果表明,TRAIL誘導的U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA細胞凋亡無論有無AT406處理均比對照組U2OS/pSUPER的細胞凋亡率有所增加。流式細胞術表明TRAIL誘導的細胞死亡是經過細胞凋亡一系列過程的。然而,Rocaglamide作用下,在兩種細胞中,TRAIL誘導細胞死亡都很明顯且死亡率大體相同,表明c-FLIP-siRNA與Rocaglamide的作用機制是完全相同的。結論：通過利用c-FLIP-siRNA或Rocaglamide抑制c-FLIP表達均可增強TRAIL誘導的U20S細胞凋亡,表明抑制c-FLIP表達是癌癥治療的一個靶標。
[Abstract]:In order to study the effect of c - FLIP on TRAIL - induced apoptosis in tumor cells , it was found that the expression of c - FLIP combined with broad - spectrum IAP antagonist AT406 increased the apoptosis of TRAIL - induced cancer cells . indicating that inhibition of c - FLIP expression is a target for cancer treatment .
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1

【參考文獻】

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1 杜亞平;張澤富;忽景泰;吳懷敏;謝建軍;;RNAi靶向沉默c-FLIP(L)基因對大腸癌細胞凋亡的影響[J];大家健康(學術版);2013年13期

2 張寬仁;張繼虹;沈悅海;彭瓊;范應仙;;凋亡因子(TRAIL)對癌細胞凋亡的機制研究[J];昆明理工大學學報(自然科學版);2012年01期

3 白愛民;賈艷敏;張曉菁;;siRNA為基礎的RNAi在腫瘤基因治療中的應用進展[J];中華腫瘤防治雜志;2007年12期

4 彭瓊;沈悅海;王冠林;張寬仁;;細胞存亡調控蛋白c-FLIP:癌細胞TRAIL耐受的關鍵蛋白[J];生命科學;2013年08期

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本文編號：1942455