本文選題：華蟾素 + U2OS細胞��； 參考：《華中科技大學》2015年博士論文

【摘要】：第一部分華蟾素誘導骨肉瘤細胞凋亡及其可能機制實驗研究 [目的]：探討華蟾素誘導骨肉瘤U20S細胞凋亡的效果及其可能機制。 [方法]：將不同濃度華蟾素作用于骨肉瘤U20S細胞,MTT法被用來檢測每組骨肉瘤細胞的生長抑制率,TUNEL染色法被用來觀察細胞凋亡程度并計算其凋亡率,免疫熒光染色、RT-PCR、以及Western Blot被用來檢測凋亡相關以及Wnt/β-catenin通路相關蛋白。 [結果]：嚴格按照上述方法處理骨肉瘤U20S細胞后,MTT結果顯示,隨著華蟾素濃度和作用于細胞時間的增加,細胞生長抑制率明顯增加,并呈時間-濃度依賴性關系。當華蟾素作用于骨肉瘤細胞不同時間后,細胞凋亡以及凋亡率隨著作用時間的延長,其變化程度增加也更加明顯。與作用于細胞24、48h相比,華蟾素處理細胞72h后細胞中凋亡相關蛋白bax的表達逐漸增加,而bcl-2逐漸減少,并且bax/bcl-2比值也增加明顯(P0.05)。Wnt/β-catenin通路相關蛋白β-catenin的表達量與華蟾素作用時間也呈正相關。 [結論]：華蟾素能誘導骨肉瘤細胞凋亡,其效果呈濃度和時間依賴性,而其機制可能與激活Wnt/β-catenin通路有關。 第二部分華蟾素聯(lián)合化療藥物在骨肉瘤細胞中抗腫瘤作用的實驗研究 [目的]：探討華蟾素聯(lián)合化療藥物在骨肉瘤細胞中的抗腫瘤作用。 [方法]：將實驗分為四組,即對照組、華蟾素組、紫杉醇組、華蟾素+紫杉醇(聯(lián)合組)。MTT法用來衡量各組骨肉瘤細胞的生長抑制情況,TUNEL染色用來觀察細胞凋亡程度并計算其凋亡率,免疫熒光染色、RT-PCR、以及Western Blot用來檢測凋亡相關以及’Wnt/β-catenin通路相關蛋白。 [結果]：MTT試驗結果顯示,當不同組別藥物作用于骨肉瘤U20S細胞后,華蟾素組細胞生長抑制率低于紫杉醇組,但聯(lián)合組細胞生長抑制率明顯增加。當華蟾素聯(lián)合紫杉醇作用于骨肉瘤U20S細胞48h后,其凋亡率增加的程度較單獨用藥更加明顯(P0.05)。免疫熒光染色顯示：在華蟾素、紫杉醇、以及二者聯(lián)合用藥分別作用于骨肉瘤細胞后,被測蛋白bax、β-catenin的熒光強度較對照組均有所增強,而bcl-2熒光強度有所減弱,但聯(lián)合組上述蛋白熒光強度變化更明顯。免疫熒光、RT-PCR、以及Western Blot結果顯示：華蟾素、紫杉醇、及二者聯(lián)合用藥均能使bax、β-catenin表達增加,而使bcl-2表達減少,但聯(lián)合用藥對上調(diào)bax和β-catenin表達及下調(diào)bcl-2表達能力均強于單獨用藥(P0.05)。 [結論]：華蟾素聯(lián)合紫杉醇對骨肉瘤具有明顯的抗腫瘤效果,能促進bax和抑制bcl-2的表達,其機制可能與激活Wnt/β-catenin通路有關。
[Abstract]:Part I Experimental study on apoptosis of osteosarcoma cells induced by cinobufacin and its possible mechanism Objective: to investigate the effect of cinobufacin on apoptosis of osteosarcoma U20S cells and its possible mechanism. [methods] different concentrations of cinobufacin were applied to U20S cells of osteosarcoma. MTT method was used to detect the growth inhibition rate of each group of osteosarcoma cells. Tunel staining was used to observe the degree of apoptosis of osteosarcoma cells and calculate the apoptosis rate of U20S cells. Immunofluorescence staining was used to detect apoptosis-related and Wnt/ 尾 -catenin pathway related proteins, as well as Western Blot. [results]: after U20S cells were treated strictly according to the above methods, MTT results showed that with the increase of the concentration of cinobufacin and the time of action on the cells, the growth inhibition rate of U20S cells increased significantly in a time-concentration-dependent manner. When cinobufacin was exposed to osteosarcoma cells for different time, apoptosis and apoptosis rate increased significantly with the prolongation of time. The expression of apoptosis-related protein (bax) was gradually increased after 72 h treatment with cinobufacin, but the expression of bcl-2 decreased gradually, compared with that of 24 cells treated with cinobufacin for 48 h. The expression of 尾 -catenin, a protein associated with the P0.05N / 尾 -catenin pathway, was also positively correlated with the time of action of cinobufacin. [conclusion]: cinobufacin can induce apoptosis of osteosarcoma cells in a concentration and time dependent manner, and its mechanism may be related to the activation of Wnt/ 尾 -catenin pathway. The second part of the experimental study on the anti-tumor effect of cinobufacin combined with chemotherapeutic drugs in osteosarcoma cells Objective: to investigate the anti-tumor effect of cinobufacin combined with chemotherapeutic drugs in osteosarcoma cells. [methods] the experiment was divided into four groups: control group, cinobufacin group and paclitaxel group. MTT assay was used to measure the growth inhibition of osteosarcoma cells in each group. Tunel staining was used to observe the degree of apoptosis and calculate the apoptosis rate of osteosarcoma cells. Immunofluorescence staining was used to detect apoptosis-related and 尾 -catenin pathway related proteins by RT-PCR and Western Blot. [results] the cell growth inhibition rate of cinobufacin group was lower than that of paclitaxel group, but the cell growth inhibition rate of combination group was significantly higher than that of paclitaxel group. When cinobufacin combined with paclitaxel was treated with osteosarcoma U20S cells for 48 h, the apoptotic rate of U20S cells increased more significantly than that of P0.05 alone. Immunofluorescence staining showed that the fluorescence intensity of Baxand 尾 -catenin in osteosarcoma cells treated with cinobufacin, paclitaxel and taxol were increased, but the fluorescence intensity of bcl-2 was decreased. However, the fluorescence intensity of the above mentioned proteins in the combined group was more obvious. The results of immunofluorescence RT-PCRand Western Blot showed that cinobufacin, paclitaxel and their combination could increase the expression of baxand 尾 -catenin, but decrease the expression of bcl-2, but the ability of combination therapy to up-regulate the expression of bax and 尾 -catenin and down-regulate the expression of bcl-2 was stronger than that of P0.05. [conclusion]: cinobufacin combined with paclitaxel has obvious antitumor effect on osteosarcoma, can promote bax and inhibit the expression of bcl-2, and its mechanism may be related to the activation of Wnt/ 尾 -catenin pathway.
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1

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