本文選題：椎間盤(pán)退行性疾病 + 軟骨終板干細(xì)胞��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景:腰椎間盤(pán)退行性病變(degenerative disc disease,DDD)是人類(lèi)的一類(lèi)較嚴(yán)重的慢性病,也是導(dǎo)致腰部疼痛(low back pain,LBP)發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵誘因,在很大程度上致使了人類(lèi)生活幸福感得下降。如今臨床上用來(lái)對(duì)付DDD的主流方法是手術(shù)療法和保守療法這兩大措施。其中手術(shù)療法一般是椎間盤(pán)融合術(shù)以及髓核切除術(shù)這兩種主流通行的手術(shù)途徑。雖然手術(shù)治療能夠在一定程度上通過(guò)去除病變組織從而緩解患者的痛苦,但是這并沒(méi)有從根本上去解決椎間盤(pán)退變所導(dǎo)致的功能缺失。近些年,快速前進(jìn)的生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域,帶給了脊柱外科一些新的防治手段,結(jié)合生物組織工程應(yīng)用、干細(xì)胞治療,不少學(xué)者提出這二者的結(jié)合可能是防治DDD的新方法。此前的報(bào)道顯示髓核(Nucleus pulposus,NP)的營(yíng)養(yǎng)是由椎間盤(pán)中的軟骨終板(cartilage endplate,CEP)組織是供應(yīng)的,且CEP還是其主要的通道,因此不少研究者認(rèn)為如果CEP發(fā)生退化,也將成為誘使椎間盤(pán)退行性病變發(fā)生的關(guān)鍵誘因之一。2011年,CEP中存在著干性細(xì)胞的這一現(xiàn)象首先被我們的研究小組發(fā)現(xiàn),這類(lèi)干性細(xì)胞被稱(chēng)為軟骨終板干細(xì)胞(cartilage endplate derived stem cells,CESCs)。此外研究小組的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CESCs具有較強(qiáng)的克隆形成能力,擁有多向分化的潛能,所以CESCs具有成為防治DDD和生物組織工程應(yīng)用中新的細(xì)胞資源的可能性。早前的研究提示CEP細(xì)胞能夠定向遷移到NP組織并可以成功轉(zhuǎn)變成為NPCs。假如我們能夠激活CESCs,促使其增殖,調(diào)節(jié)其分化,且維持住CEP的健康形態(tài),繼而誘導(dǎo)CESCs定向朝NP組織遷移,將會(huì)給DDD的治療帶來(lái)新的途徑。力生長(zhǎng)因子(mechano growth factor,MGF)在1996年被Yang等人發(fā)現(xiàn)。研究顯示MGF屬于類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)家族,是其數(shù)個(gè)剪接變異體的其中一個(gè),在動(dòng)物體內(nèi)被稱(chēng)為IGF-1Eb,在人體內(nèi)則被命名為IGF-1Ec。多項(xiàng)報(bào)告提示MGF廣泛出現(xiàn)在許多組織,除了能刺激成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞等力效應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)增殖和遷移的行為以外,此外還能延遲成骨分化行為的發(fā)生,最重要的是還擁有在組織遭受損害時(shí)減少細(xì)胞死亡數(shù)量的作用。其中MGF刺激細(xì)胞增殖和遷移的作用主要與Erk的活化有關(guān),即其磷酸化水平的增加可導(dǎo)致上述行為的發(fā)生。最近的報(bào)告顯示mgf能夠誘使bmscs遷移效應(yīng)的發(fā)生�？紤]到cescs是一類(lèi)間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞,在細(xì)胞學(xué)特性方面和bmscs擁有類(lèi)似的特點(diǎn),據(jù)此我們猜測(cè)cescs在mgf的刺激下也許能產(chǎn)生同樣的效應(yīng)。但國(guó)內(nèi)外針對(duì)mgf對(duì)cescs的效應(yīng)和控制效應(yīng)發(fā)生的機(jī)制的報(bào)道非常少。本課題通過(guò)相應(yīng)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),觀察cescs在mgf的刺激下,其增殖、遷移和分化行為發(fā)生的變化,并對(duì)mgf部分效應(yīng)的調(diào)節(jié)途徑也做一定的摸索。研究目的:此課題是依靠臨床手術(shù)收集患者的退變腰椎間盤(pán)cep組織,使用機(jī)械清除法去除cep周?chē)鸁o(wú)用部分,剪碎cep,用ii膠原酶消化cep獲得cep細(xì)胞。提取得到的cep細(xì)胞通過(guò)瓊脂糖篩選系統(tǒng)后再體外擴(kuò)增培養(yǎng),展開(kāi)一系列體外試驗(yàn),包括鑒定cescs的干性,觀察cescs在mgf的刺激下其增殖、遷移和分化的變化。證實(shí)提取的軟骨終板細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,以及mgf對(duì)cescs細(xì)胞增殖、遷移、分化的影響以及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:從臨床上選取多例因腰椎間盤(pán)退變需行椎間盤(pán)融合術(shù)的患者,在患者行融合術(shù)后收集取出的椎間盤(pán)組織,超凈工作臺(tái)下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理,磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer,pbs)處理完,標(biāo)本剪成大小不超過(guò)1mm3得碎塊,用1%ii型膠原酶在37℃下過(guò)夜消化,獲得cep細(xì)胞后,加入適量完全培養(yǎng)液后放置到培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。采用瓊脂糖篩選系統(tǒng)篩選培養(yǎng)后,使用流式細(xì)胞儀測(cè)定干細(xì)胞標(biāo)志物,進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化染色鑒定。選取篩選后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的cescs,加入不同濃度的mgf溶液,進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用westernblot檢測(cè)erk磷酸化的表達(dá)。選取篩選后的cescs細(xì)胞進(jìn)行成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn),加入mgf,誘導(dǎo)周期結(jié)束后,使用qpcr測(cè)定成骨、成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上,拍攝的照片被拿來(lái)做定性分析,數(shù)據(jù)用spss20.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,定量數(shù)據(jù)采取平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式實(shí)施顯示,兩個(gè)組之間可以使用t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比,多組可以采取單因素方差分析進(jìn)行顯示。本次試驗(yàn)設(shè)定p0.05是表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.獲取得cep細(xì)胞通過(guò)瓊脂糖系統(tǒng)篩選擴(kuò)增后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物以及三系誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)證實(shí)篩選的cep細(xì)胞擁有干細(xì)胞生物學(xué)特性,為cescs。2.cescs增殖實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)cck-8檢測(cè),顯示實(shí)驗(yàn)組(mgf組)od值高于對(duì)照組,其中4.5ng/ml組最顯著(P0.05)。并且用Erk拮抗劑PD98059預(yù)先作用CESCs后,MGF的促增殖作用顯著下降(P0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)同樣提示實(shí)驗(yàn)組(MGF組)遷移細(xì)胞數(shù)目多于對(duì)照組,其中4.5ng/ml組細(xì)胞數(shù)目最多(P0.05)。醋酸溶液洗脫結(jié)晶紫后,用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度,4.5ng/ml組的OD值也是最大的(P0.05)。用IGF-1R拮抗劑PQ401預(yù)處理細(xì)胞后,MGF誘使細(xì)胞發(fā)生遷移行為的作用降低(P0.05)。Western blot證實(shí)4.5ng/ml時(shí)Erk磷酸化水平顯著增高(P0.05),加入IGF-1R抑制劑PQ401后,Erk磷酸化顯著下降(P0.05)。3.CESCs分化實(shí)驗(yàn)中,特殊染色實(shí)驗(yàn)顯示MGF能抑制CESCs成骨分化,促進(jìn)成軟骨分化;通過(guò)qPCR測(cè)量,成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組(MGF組)CESCs成骨相關(guān)基因表達(dá)降低,說(shuō)明MGF在該濃度水平下抑制CESCs成骨誘導(dǎo)分化。成軟骨分化實(shí)驗(yàn)中,特殊染色實(shí)驗(yàn)顯示MGF促進(jìn)CESCs成軟骨分化;實(shí)驗(yàn)組(MGF組)CESCs成軟骨相關(guān)基因表達(dá)相比對(duì)照組提升了很多,提示MGF在該濃度水平下促進(jìn)了CESCs的成軟骨分化。結(jié)論:1.證實(shí)從CEP獲取的細(xì)胞經(jīng)瓊脂糖篩選系統(tǒng)的篩選后是CESCs,擁有干細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì);2.證實(shí)MGF能誘導(dǎo)CESCs發(fā)生增殖和遷移的行為,該作用與Erk通路的活性有聯(lián)系,其磷酸化水平增高促進(jìn)上述行為的發(fā)生。其中IGF-1R為MGF促遷移作用中的關(guān)鍵元件。3.MGF擁有提升CESCs向成軟骨分化及降低CESCs向成骨分化的作用。
[Abstract]:Background : degenerative disc disease ( DDD ) is one of the most serious chronic diseases in humans , and it is a key factor leading to the occurrence of low back pain . This study suggests that the proliferation , migration and differentiation of CESCs can lead to the proliferation , migration and differentiation of the cells . The results suggest that MGF is a kind of mesenchymal origin cell which can induce the proliferation , migration and differentiation of the cells . The results were as follows : 1 . After screening and amplification of cep cells , the cell markers were measured by flow cytometry . The results showed that the number of cells in the experimental group was higher than that in the control group ( P0.05 ) . IGF - 1R is the key element in promoting migration of MGF . 3 . MGF has the function of promoting differentiation of CESCs to chondrogenic differentiation and decreasing the differentiation of CESCs into osteogenic differentiation .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R681.53

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本文編號(hào)：1835218