本文選題：microRNA-27a + BMSC　； 參考：《鄭州大學》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景:股骨頭壞死是一種臨床上非常常見的關節(jié)疾病,該病病因復雜,致殘率高,一旦發(fā)病往往需要手術治療,迄今罕有有效的預防方法,對患者的生活質量和生命健康都是一種嚴重威脅。目前非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)日益多見,大量研究證明,慢性股骨頭壞死多與激素和酒精的攝入有關。統(tǒng)計數據顯示,在中國,慢性酒精中毒已經是誘發(fā)ONFH的主要原因之一。有研究表明,通過對大鼠、小鼠、家兔和雞等長期使用大劑量酒精灌胃處理后,動物會在一定時間后出現明顯的股骨頭壞死現象。骨髓基質干細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是一種多能干細胞,主要分化為成骨細胞,并能夠分化為脂肪細胞、心肌細胞和神經細胞等。體外培養(yǎng)的BMSCs經過酒精誘導后,會大量分化成脂肪樣細胞,喪失成骨能力。過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)基因是一種關鍵的成脂轉錄因子,其在脂肪細胞中表達量非常高,且PPARγ的激活與干細胞的分化命運密切相關。大量研究表明,BMSC中PPARγ的激活會導致細胞成骨分化受阻,細胞轉而向成脂方向分化,該過程在股骨頭壞死過程中表現為骨質喪失和骨骼或關節(jié)修復受阻。Micro RNA是一種長度約20~24個核苷酸的短鏈非編碼RNA,不同類型的micro RNA根據其特異的核苷酸序列可以靶向作用于不同基因的m RNA,在m RNA轉錄后水平調控基因的表達狀況。micro RNAs的正常表達對維持正常生命活動至關重要,至今已經發(fā)現約60%的人類基因受micro RNAs的調控。一個micro RNA可以靶向調節(jié)多個基因,并且一個基因也可以被多個micro RNAs所調控。我們通過生物信息學數據庫發(fā)現micro RNA-27a能夠與PPARγ基因靶向配對,抑制BMSC中PPARγ的表達,阻礙BMSC的成脂分化,進而使BMSC正常的成骨分化能力得以恢復,從而達到對酒精性ONFH發(fā)生的抑制作用。研究目的:本實驗通過體外合成micro RNA-27a mimics導入大鼠BMSCs細胞,觀察micro RNA-27a對PPARγ基因的靶向調控作用,及對酒精誘導的BMSC成脂和成骨分化的影響,以此探討micro RNA在ONFH的發(fā)生及防治中的作用。方法:1.實驗分組:將大鼠BMSCs以1×106/cm2細胞密度,接種于6孔培養(yǎng)板,當細胞融合至80%時應用micro RNA mimics進行電擊穿孔法轉染,同時隨機分組:①空白對照組:正常培養(yǎng)細胞,不做特殊處理。②酒精模型組:培養(yǎng)液中給予0.09 mol/L的酒精。③micro RNA-27a組:micro RNA-27a mimics轉染細胞,并給予濃度為0.09mol/L的酒精同時處理。④Negative control組:無關序列合成mimics轉染細胞,并給予濃度為0.09mol/L的酒精同時處理。2.熒光素酶報告基因實驗檢測micro RNA-27a與PPARγ3’UTR的結合情況。3.實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR)檢測各組BMSCs中PAPRγ和Runx2基因表達的水平。4.酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、I型膠原(type I collagen)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)含量的差異。5.免疫印跡法(Western blot)檢測各組BMSCs中Runx2和PPARγ的蛋白表達水平。6.脂肪染色及脂肪細胞計數檢測BMSCs酒精誘導后脂肪生成的狀態(tài)和成脂分化的程度。7.酶偶聯比色法檢測BMSCs中甘油三酯(TG)的含量。結果:1)熒光素酶報告基因實驗證實micro RNA-27a可以與PPARγ3’-UTR相結合,即PPARγ是micro RNA-27a的靶基因。2)q PCR結果顯示:酒精處理后,酒精模型組和NC組BMSC中PPARγm RNA表達量均高于空白對照組和micro RNA-27a組(P0.01),空白對照組和micro RNA-27a組比較,以及酒精模型組和NC組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05);與此相反,酒精模型組和NC組BMSC中Runx2 m RNA表達量均低于空白對照組和micro RNA-27a組(P0.01),空白對照組與micro RNA-27a組比較,以及酒精模型組和NC組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。3)ALP檢測結果顯示:與空白對照組比較,酒精模型組和NC組BMSC經酒精處理后ALP含量均有下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而micro RNA-27a組中ALP含量與空白對照組近似,差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。4)I型膠原檢測結果顯示:與空白對照組比較,酒精模型組和NC組BMSC經酒精處理后I型膠原含量均有下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而micro RNA-27a組中I型膠原含量與空白對照組近似,差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。5)OCN檢測結果顯示:酒精模型組和NC組培養(yǎng)液中OCN的含量與空白對照組及micro RNA-27a組比較均有下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)�？瞻讓φ战M與micro RNA-27a組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。6)Western blot結果顯示:酒精模型組和NC組與空白對照組比較BMSC中PPARγ的蛋白表達量明顯上升(P0.01),micro RNA-27a組PPARγ蛋白表達水平與空白對照組接近,差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。同時,酒精模型組和NC組與空白對照組比較BMSC中Runx2的蛋白表達量明顯下降(P0.01),micro RNA-27a組Runx2蛋白表達水平與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。7)脂肪染色及脂肪細胞計數結果:油紅O染色顯示,空白對照組和micro RNA27a組細胞中罕見脂滴生成且極少出現脂肪細胞;酒精模型組及NC組細胞,胞質內出現較多脂肪滴且有大量脂肪細胞生成,著色后呈棕紅色。脂肪細胞計數結果顯示,酒精模型組和NC組脂肪細胞生成數比micro RNA-27a組和空白對照明顯增多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01);空白對照組與micro RNA-27a組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。8)TG含量測定結果顯示,酒精模型組和NC組表達含量均高于空白對照組與micro RNA-27a組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。空白對照組與micro RNA-27a組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P㧐0.05)。結論:1.micro RNA27a能夠靶向調節(jié)PPARγ基因,下調BMSC中PPARγ基因的表達,減少脂肪細胞生成,降低細胞中TG的含量,抑制酒精誘導的BMSCs成脂分化能力。2.BMSCs細胞中Runx2基因表達的升高,ALP活性、I型膠原和OCN含量的增加,促進BMSCs成骨分化。3.micro RNA27a在預防酒精性ONFH發(fā)生中發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:Bone marrow stromal cells ( BMSC ) are a key factor in the development of bone marrow stromal cells ( bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells , bone marrow stromal cells and neural cells ) . Objective : To investigate the effect of micro RNA - 27a on PPAR緯 gene expression and to investigate the effect of micro RNA - 27a on PPAR緯 gene expression . Compared with blank control group , the expression of PPAR緯 mRNA in the alcohol model group and NC group was significantly higher than that in blank control group ( P0.01 ) . Conclusion : 1 . MicroRNA27a can regulate PPAR緯 gene , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the expression of PPAR緯 gene in BMSC , decrease the content of TG in BMSC , inhibit the increase of activity of ALP , type I collagen and OCN , and promote the differentiation of bone into bone . 3 . MicroRNA27a plays a role in preventing alcoholic ONFH .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.8

【參考文獻】

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本文編號：1740041